Vitamin D Metabolite Analysis in Biological Samples Using Agilent Captiva EMR—Lipid

Význam tématu

Odborná analýza 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 je klíčová pro hodnocení stavu vitaminu D v klinické praxi a výzkumu.
Matrix biologických vzorků, především lipidy a fosfolipidy, však negativně ovlivňuje spolehlivost LC/MS/MS měření.
Efektivní odstranění lipidových interferentů je nezbytné pro dosažení vysoké citlivosti, přesnosti a reprodukovatelnosti výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie je ověřit a popsat robustní postup přípravy vzorků využívající sorbent Agilent Captiva EMR—Lipid v kombinaci s in situ precipitací bílkovin.
Metoda je navržena pro 96-well formát, kde probíhá současně proteinová precipitace a průchod vzorku sorbentem, který selektivně váže lipidy.
Následná LC/MS/MS analýza poskytuje kvantifikaci 25-OH D2 a D3 s vysokou přesností a minimálním vlivem matricových efektů.

Použitá metodika a instrumentace

• Sample preparation:
  • 96-well destička Captiva EMR—Lipid pro in situ PPT s 400 µl acetonitrilu + 1 % formic acid.
  • Odstředěný elutát protéká sorbentem, který odstraňuje lipidy kombinací velikostní exkluze a hydrofobní interakce.
• LC/MS/MS:
  • UHPLC: Agilent 1290 Infinity II (pumpa G7120A, autosampler G7167B, termostat G7116B).
  • Kolona: Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm, 2.7 µm s EC-C18 guard column.
  • Mobilní fáze: voda/Methanol, obě s 0,1 % formic acid; gradient 75–98 % B; teplota 30 °C; injekce 20 µl.
  • MS: Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS s Jet Stream; režim Dynamic MRM, pozitivní ionizace, specifické MRM přechody pro 25-OH D2, D3 a jejich deutero-izotopy.

Hlavní výsledky a diskuse

• Přesnost intradení a mezipřesná: 90–110 % pro všechny QC úrovně, preciznost <10 % RSD.
• Linearity kalibračních křivek: R2 >0,992 v rozsahu 10–750 ng/ml.
• Fosfolipidové interferenty byly odstraněny >99 % (prekurzorový scan m/z=184).
• Matrixové efekty po čištění s EMR—Lipid vykazují <3 % RSD, oproti >25 % RSD při standardní precipitaci proteinů.
• Postcolumn infusion prokázalo, že metoda výrazně redukuje potlačení signálu v retenční oblasti analytů.
• Absolutní recovery: 89–106 % pro 25-OH D2/D3 s RSD <15 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a jednoduchý proces přípravy vzorků v 96-well formátu bez náročných etap SPE.
• Minimalizace carry-over a vysoká robustnost metody umožňují spolehlivá klinická a výzkumná měření.
• Přímá injekce eluentu po čištění šetří čas a snižuje riziko chyb v laboratorním workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace EMR—Lipid na multiklasové analýzy léčiv a dalších bioaktivních látek.
• Adaptace postupu na komplexní matice z potravinářství a environmentálních vzorků.
• Integrace s automatizovanými platformami pro vysokopropustné laboratorní analýzy.

Závěr

Metoda s využitím Agilent Captiva EMR—Lipid nabízí spolehlivou, citlivou a reprodukovatelnou analýzu 25-OH Vitaminu D v biologických vzorcích.
Výrazné odstranění lipidových interferentů a jednoduchý workflow ji činí vhodnou pro rutinní klinické i výzkumné aplikace.

Reference

1. Agilent Technologies, L. Zhao, D. Lucas: Agilent Technologies publication number 5991-8006EN.
2. FDA Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, 2001 (HHS, CDER, CVM).
3. Agilent Technologies, L. Zhao, D. Lucas: Agilent Technologies publication number 5991-8007EN.