LC/MS/MS Separation of Cholesterol and Related Sterols in Plasma on an Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC‑C18 Column

Význam tématu

Analýza cholesterolu a s ním příbuzných sterolů v plazmě je klíčová pro klinický výzkum a diagnostiku metabolických poruch. Přesná kvantifikace těchto nepolárních sloučenin umožňuje sledovat hladiny biologicky významných markerů, hodnotit funkčnost hormonálních drah a interpretovat účinky farmakoterapie či výživových intervencí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo optimalizovat LC/MS/MS metodu pro simultánní separaci 12 sterolů v plazmě za použití plochých částic InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 a SB-C18. Autoři porovnali selektivitu a rozlišení dvou fazí i dvou velikostí částic a stanovili nejvýhodnější podmínky pro vysoce citlivou detekci APCI zdrojem.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá gradientní eluce s mobilní fází voda/methanol při 15 °C a průtoku 0,6 mL/min.

• Kolony: InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (3,0 × 100 mm, 2,7 µm a 1,9 µm) a SB-C18 (3,0 × 100 mm, 2,7 µm)
• LC systém: Agilent 1290 Infinity II (pumpa, autosampler, termostat)
• Detekce: Agilent 6460A triple kvadrupól LC/MS/MS s APCI v pozitivním módu
• Optimalizované parametry APCI: kapilární napětí 2000 V, teplota vaporizéru 350 °C, sušící plyn 4 L/min
• Objem injekce: 20 µL

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání SB-C18 a EC-C18 ukázalo, že EC-C18 lépe rozlišuje kritické isomery lathosterol / cholesterol. Použití menších částic (1,9 µm) vedlo k výraznému zlepšení rozlišení úzkých špiček. Optimalizace APCI parametrů, zejména kapilárního napětí, zajistila stabilní a citlivý signál. Metoda dosahuje rozlišení všech 12 sterolů při koncentraci 10 ppb s výbornou reprodukovatelností (< 2 % RSD při 10 opakovaných injekcích). V plazmatickém vzorku byla při poměru cholesterol:lathosterol ~ 2000:1 detekce lathosterolu úspěšná díky vysoké selektivitě chromatografie.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysoce citlivou a selektivní kvantifikaci sterolů v biologických maticích
• Spolehlivou separaci izobarických struktur bez nutnosti derivatizace
• Rychlou analýzu vhodnou pro rutinní klinické laboratoře i farmaceutické aplikace

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k multiplexním analýzám s rozšířením počtu sterolů a jejich metabolitů, ke kombinaci s vysokorozlišovacími hmotnostními analyzátory a k automatizaci přípravných postupů. In-line SPE či mikroextrakce by mohly dále zvýšit citlivost a robustnost pro sledování velmi nízkých hladin.

Závěr

Optimalizovaná LC/MS/MS metoda na InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (1,9 µm) s APCI poskytuje vynikající rozlišení a citlivost pro analýzu 12 sterolů v plazmě. Umožňuje spolehlivé stanovení izobarických párů, zejména lathosterolu a cholesterolu, i při vysokém přebytku cholesterolu.

Reference

1. McDonald J. G.; et al. A comprehensive method for extraction and quantitative analysis of sterols and secosteroids from human plasma. J. Lipid Res. 2012, 53(7), 1399–1409.