Monitoring of Mammalian Cell Culture Media with HILIC LC/MS

Význam tématu

Metabolomika buněčných kultur hraje klíčovou roli v optimalizaci bioprocesů a ve výzkumu buněčné biologie. Sleduje spotřebu živin a sekreci odpadních metabolitů, což je zásadní pro regulaci růstu, kvalitu produkce a prevenci toxických akumulací.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace byla validace robustní a citlivé HILIC LC/MS metody pro monitorování živin (glukóza, aminokyseliny) a odpadních produktů (laktát, organické kyseliny z TCA cyklu) v médiu kultivovaných savčích buněk během šestiměsíčního časového průběhu. Studie zahrnovala optimalizaci chromatografie, test solné tolerance a praktický běh na buňkách K562.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda je založena na hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) s Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z sloupcem (2,1 × 50 mm, 2,7 µm, PEEK-lined) a Agilent 6545 Q-TOF MS v negativním ionizačním režimu.

• Mobilní fáze A: 10 mM amonium acetát, pH 9, s 5 µm deaktivátorem
• Mobilní fáze B: 10 mM amonium acetát ve směsi voda/ACN 10:90 (v/v), pH 9, s deaktivátorem
• Gradient: 0–2 min 95 % B, 2–12 min 95→50 % B, 12–13 min 50→95 % B, 13–21 min 95 % B
• Flow rate 0,25 mL/min, teplota sloupce 25 °C, objem injekce 1 µL

Podrobná přístrojová sestava:

• Agilent 1290 Infinity LC (binary pump, autosampler s termočlánkem, termostat sloupce)
• Agilent 6545 Q-TOF s Jet Stream Source, negativní ESI, m/z 50–1000
• Kontinuální kalibrace hmotového spektra referenčním roztokem (m/z 980,01638)

Hlavní výsledky a diskuse

1. Solná tolerance: Přídavky až do 40 % ekvivalentu solí z lidského moči (80 mM močovina, 40 mM NaCl) neovlivnily významně tvar špiček ani opakovatelnost retenčních časů u nukleotidů a fosforylovaných sacharidů.
2. Časový monitoring: Během šesti dnů kultivace buněk K562 vzrůstala koncentrace laktátu, malátu, α-ketoglutarátu, glutamátu a citrátu, zatímco hladiny glukózy a vybraných aminokyselin (serin, valin, leucin, isoleucin, glutamin aj.) klesaly až k vyčerpání.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorázové sledování širokého spektra polarních metabolitů v médiu s vysokým obsahem solí
• Vysoká opakovatelnost retenčních časů a stabilní detekční výkon
• Uplatnění v kontrole kvality buněčných kultur, vývoji biotechnologických procesů a farmacokinetických studiích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace této platformy s dalšími omickými přístupy (proteomika, lipidomika), rozšíření na monitoring bioreaktorů v reálném čase a aplikace v personalizované medicíně pro sledování metabolického profilu pacientských buněk.

Závěr

Kombinace InfinityLab Poroshell HILIC-Z a Agilent 6545 Q-TOF LC/MS nabízí citlivou a reprodukovatelnou metodu pro komplexní profilování metabolitů v savčích buněčných kulturách, umožňující efektivní řízení bioprocesů a kvality buněčného růstu.

Reference

• Wishart DS. Emerging applications of metabolomics in drug discovery and precision medicine. Nat Rev Drug Discov. 2016;15(7):473-484.
• Silva LP, et al. Exometabolomics and MSI: deconstructing how cells interact to transform their small molecule environment. Curr Opin Biotechnol. 2015;34:209-216.
• Garcia-Manteiga JM, et al. Metabolomics of B to plasma cell differentiation. J Proteome Res. 2011;10(9):4165-4176.
• Zhang Z, et al. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Anal Chem. 2012;84(4):1994-2001.
• Panuwet P, et al. Biological Matrix Effects in Quantitative Tandem Mass Spectrometry-Based Analytical Methods: Advancing Biomonitoring. Crit Rev Anal Chem. 2016;46(2):93-105.
• Pesek JJ, et al. Improvement of peak shape in aqueous normal phase analysis of anionic metabolites. J Sep Sci. 2011;34(24):3509-3516.