Quantitative Proteomics of Metabolic Enzymes in S. cerevisiae Using Triple Quadrupole LC/MS/MS

Význam tématu

Quantitativní sledování enzymů v mikrobiálních bioreaktorech je klíčové pro optimalizaci produkce biopaliv, farmaceutik a potravinářských surovin. Cílená proteomika pomocí LC-MS/MS umožňuje detailní kvantifikaci vybraných tryptických peptidů bez nutnosti protilátek, čímž nabízí vysokou citlivost a specifitu.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na porovnání expresních úrovní metabolických enzymů v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae (divoký kmen S288C a mutanti BY4742 s jednotlivými delecemi genů). Hlavním cílem bylo demonstrovat schopnosti ultra rychlých masových spektrometrů (UFMS) pro vysoce propustné MRM měření více než 2 800 přechodů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byl použit nano-LC systém Prominence Nano spojený s LCMS-8040 vybaveným Nano ESI rozhraním. Mobilní fáze obsahovala 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě (A) a 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu (B), gradient od 10 do 40 % B během 45 min při průtoku 400 nL/min přes kapilární kolonku L-Column ODS (0,1×150 mm). Metoda S/MRM využila knihovnu přechodů pro 137 enzymů, sledovaných včetně izotopově značených peptidů.

Hlavní výsledky a diskuse

Monitoring 303 peptidů z divokého kmene a 409 peptidů z mutantů potvrdil změny úrovní enzymu Gnd1p u gnd1Δ, Pfk1p a Zwf1p v závislosti na delecích genů. UFMS technologie zajistila reprodukovatelné měření i při vysoké rychlosti skenování (1 ms dwell time a 1 ms pause), což prokázalo možnost sledovat dynamiku stovek proteinů z komplexních vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a specifita detekce bez potřeby protilátek.
• Možnost simultánního sledování stovek enzymů v jedné analýze.
• Rychlá data i při krátkých dolech, vhodné pro dynamické studie metabolismu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření mimo modelové organismy směrem k průmyslovým kmenům a komplexnímu sledování metabolických sítí in vivo. Integrace s metabolomikou a systémovou biologií otevře cestu k řízené optimalizaci produkčních kultur a personalizované medicíně.

Závěr

Studie demonstrovala efektivitu LCMS-8040 s UFMS pro kvantitativní proteomiku cílených enzymů u S. cerevisiae. Vysoká propustnost a spolehlivost měření potvrzují užitečnost metody pro průmyslové i výzkumné aplikace v oblasti biotechnologií.

Reference

1. Matsuda F, Ogura T, Tomita A, Hirano I, Shimizu H. Nano-scale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry using the multiple reaction monitoring mode based quantitative platform for analyzing multiple enzymes associated with central metabolic pathways of Saccharomyces cerevisiae using ultra fast mass spectrometry. J Biosci Bioeng. 2015 Jan;119(1):117–20.