Using Targeted Proteomics with an Ultra- Fast Triple Quadrupole Mass Spectrometer to Confirm Protein Overexpression

Význam tématu

Proteinová nadměrná exprese je klíčová metoda v základním výzkumu i v průmyslové biotechnologii, kde umožňuje studium funkce enzymů a hromadnou produkci cílových proteinů. Tradiční technika Western blot vyžaduje specifická protilátková činidla, což může být časově i finančně náročné, zejména u nekomerčně dostupných proteinů. Cílená proteomika na bázi MRM režimu s trojnásobným kvadrupólem nabízí rychlé, kvantitativní a univerzální řešení bez potřeby protilátek.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na potvrzení nadměrné exprese fosfoglukokinázy (Pgk) v Escherichia coli konstruktovaných tak, aby gen pgk přepisovaly ve zvýšené míře. Pomocí cílené proteomiky a softwaru Skyline byl vygenerován soubor MRM přechodů pro proteolytické peptidy Pgk. Analýza proběhla na rychlém trojnásobném kvadrupólu LCMS-8060 v nano-LC konfiguraci.

Použitá metodika

1. Kultivace divokého typu E. coli K-12 a Pgk-overexpresní kmen z ASKA knihovny v médiu LB s indukcí IPTG.
2. Výroba celkového proteinového extraktu pomocí lytického pufru s HEPES, glycerolem, DTT, KCl, EDTA a proteázovými inhibitory.
3. Mechanické rozrušení buněk v přítomnosti zirconia kuliček.
4. Proteolýza trypsinem podle ověřeného protokolu.
5. Automatizované vytvoření 110 MRM přechodů z FASTA sekvence Pgk v prostředí Skyline.
6. Separace tryptických peptidů reverzní fází nano-kapilární LC a kvantitativní měření MRM signálů na LCMS-8060.

Použitá instrumentace

• Software Skyline pro generování MRM metod a zpracování dat
• Shimadzu LC-20ADnano s nanoViper rozhraním
• Trap kolona L-column Micro L-C18 (0,3×5 mm, 5 μm)
• Analytická kolona L-column Micro L-C18 (0,1×150 mm, 3 μm)
• Mass spectrometer Shimadzu LCMS-8060 v MRM režimu

Hlavní výsledky a diskuse

Při analýze vzorků Pgk-overexpresního kmene se objevilo více zastřihnutých a silných vrcholů odpovídajících 16 vybraným peptidům Pgk ve 110 MRM přechodech. Intenzita signálu byla výrazně vyšší než u divokého kmene, což jednoznačně potvrdilo nadexprese Pgk. Studie také demonstrovala, že s dostatečnou citlivostí nano-LC lze metodu adaptovat na semi-mikro-LC systém určený pro malé molekuly bez větších úprav.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a přesné potvrzení nadměrné exprese proteinů bez nutnosti přípravy specifických protilátek. Umožňuje vysokopropustné kvantitativní měření v oblasti metabolického inženýrství, bioprodukce i zdravotnického výzkumu. Díky vysokorychlému trojnásobnému kvadrupólu lze zpracovat stovky přechodů v jednom běhu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření cílené proteomiky na další klíčové enzymy z E. coli a Saccharomyces cerevisiae. Optimalizace výběru peptidů s nejvyšší citlivostí a reproducibilitou. Integrace metody do QA/QC postupů v biotechnologických provozech. Využití semi-mikro-LC-TQ hmotnostních spektrometrů pro simultánní analýzu malých molekul a peptidů.

Závěr

Cílená proteomika s ultra-rychlým trojnásobným kvadrupólem prokázala vysokou efektivitu při potvrzení proteinové nadměrné exprese bez potřeby protilátek. Kombinace softwaru Skyline a LCMS-8060 přináší univerzální, rychlý a citlivý workflow vhodný pro výzkum i průmysl.

Reference

1. Kitagawa M. et al. DNA Res. 12:291-299 (2005)
2. Picotti P. et al. Cell 138:795-806 (2009)
3. Uchida Y. et al. Fluids Barriers CNS 10:21 (2013)
4. MacLean B. et al. Bioinformatics 26:966-968 (2010)
5. Matsuda F. et al. Mass Spectrometry 6:A0056 (2017)
6. Uebayashi K. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 102:7071-7081 (2018)