High Sensitive Detection and Quantification of Thirty-Two Synthetic PDE-5 Inhibitors and Analogues Adulterated in Health Supplements Using LC/MS/MS

Význam tématu

V posledních letech se objevuje nekontrolované přidávání syntetických inhibitorů fosfodiesterázy typu 5 (PDE-5), známých například z přípravků Viagra nebo Cialis, do bylinných a doplňkových přípravků pro podporu erekce. Tato praxe je nelegální a představuje zdravotní riziko pro spotřebitele, zejména proto, že se kromě oficiálně registrovaných látek vyskytují i nově syntetizované analogie s neznámými účinky.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce je vyvinout a validovat vysoce citlivou a selektivní metodu založenou na kapalinové chromatografii spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS) pro detekci a kvantifikaci 32 inhibitorů PDE-5 a jejich analogů v extraktech potravinových doplňků. Studie zahrnuje:

• přípravu směsí standardů 32 sloučenin v rozsahu 0,1–500 ppb,
• vyhodnocení detekčních (LOD) a kvantifikačních (LOQ) limitů,
• analýzu matričního efektu v pěti komerčních produktech,
• ověření opakovatelnosti metody.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky doplňků ve formě prášku nebo kapslí byly extrahovány metanolovým roztokem (0,2 g v 2 mL MeOH), sonikovány 20 minut a filtrovány přes 0,2 μm PTFE filtr. Analýza probíhala na UHPLC Nexera spojené s trojúhelníkovým kvadrupólem LCMS-8040. Parametry:

• kolona Shim-pack XR-ODS-III (150 × 2,0 mm, 2 μm),
• mobile phase A: voda + 0,1% kyselina mravenčí, B: acetonitril + 0,1% kyselina mravenčí,
• gradient B z 10 % na 80 % v průběhu 17 minut,
• průtok 0,3 mL/min, teplota kolony 45 °C, objem injekce 2 μL,
• ionizace ESI v pozitivním módu, MRM přechody optimalizované automaticky.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro všechny 32 sloučeniny byly stanoveny tři MRM přechody (u dvou analogů dva) s vybranými kvantifikačními a konfirmačními ionty. Linearita v rozsahu LOQ–500 ppb dosahovala R2 > 0,999 pro všechny látky. LOD se pohybovaly v rozmezí 0,05–2 ppb, LOQ v rozsahu 0,2–6,7 ppb. Opakovatelnost (n = 6) představovala 1,3–8,8 % RSD při 10 ppb a 0,4–7,8 % RSD při 100 ppb.
Matriční efekt ve filmových extraktech pěti doplňků se většinou pohyboval mezi 70 a 150 %, přičemž některé thioanalogy vykazovaly výraznou potlačenou ionizaci. Z analýzy poměrů kvantifikačního a konfirmačního signálu vyplynulo, že iontové potlačení nebo enhancement není způsoben přímou interferencí spoly přítomných sloučenin, ale vlastnostmi jednotlivých analyzovaných látek. Pro cílený screening se doporučují rozhodovací limity 0,1–4 ppb v extraktech (odpovídá 1–40 ng/g v prášcích) a kvantifikace od 0,4 ppb (4 ng/g).

Přínosy a praktické využití metody

Tato metoda umožňuje rychlé a spolehlivé odhalení i stopových množství známých i nových analogů inhibitorů PDE-5 v potravinových doplňcích. Představuje účinný nástroj pro kontrolní laboratoře smluvních i státních institucí, podporuje dodržování regulačních norem a zajištění bezpečnosti spotřebitelů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze dále rozšířit o vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometrii (HRMS) pro nontarget screening neočekávaných analogů. Dalšími směry jsou miniaturizace extrakce pomocí micro-SPE, automatizace přípravy vzorků a integrace do online monitorovacích systémů. S narůstající poptávkou po rychlém screeningu nových aditiv se očekává růst využití hybridních technik LC-MS a kontinuální rozvoj softwaru pro data mining.

Závěr

Vypracovaná metoda UHPLC-MS/MS s MRM přístupem nabízí vysokou citlivost, linearitu a reprodukovatelnost pro 32 syntetických inhibitorů PDE-5 a jejich analogů v doplňcích stravy. Pohotovost, spolehlivost a nízké detekční limity činí z tohoto protokolu vhodný nástroj pro rutinní analýzu a včasné odhalení nelegálního přidávání farmakologických látek do potravinových produktů.

Reference

1. Patel D.N. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 87 (2014) 176-190
2. Lee J.H. et al. Food Addit. Contam. A 30(11) (2013) 1849-1857
3. Zou P. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (2008) 279-284
4. Xing J., Aravind D., Sun Z. et al. ASMS 2015, Poster Log No. 1685