Detection and Identification of Synthetic Phosphodiesterase Type-5 Inhibitors in Adulterated Herbal Supplements Using UPLC and Data-Directed Analysis by Mass Spectrometry

Význam tématu

Adulterace bylinných doplňků stravy syntetickými inhibitory fosfodiesterázy typu 5 představuje rostoucí riziko pro veřejné zdraví.
Nelegální přidávání sildenafilu, tadalafilu či vardenafilu a jejich analogů ohrožuje pacienty, kteří nevědí o obsahu léčivých látek a mohou je kombinovat s kontraindikovanými léky.
Potřebujeme rychlé a citlivé analytické metody, které pokryjí známé i dosud nepopsané analogové látky.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyhodnotit schopnost systému UPLC spojeného s tandemovou kvadrupólovou hmotnostní spektrometrií Xevo TQ MS s funkcí Survey Scan a ScanWave DD pro detekci a identifikaci syntetických PDE5 inhibitorů v komerčně dostupných bylinných doplňcích.
Studie zahrnovala pět vzorků nakoupených přes internet, ze kterých byly zjištěny známé farmaceutické látky i neznámé analogie.

Použitá instrumentace

• UPLC systém ACQUITY UPLC s Binary Solvent Manager a Sample Manager
• Kolona ACQUITY UPLC BEH C18 2,1×100 mm, 1,7 μm při 60 °C
• MS detektor Xevo TQ MS s ionizací ESI positive
• PDA detektor, rozsah 210–400 nm, rychlost vzorkování 20 bodů/s

Použitá metodika

Vzorky (kapsle, tablety) se drtily a extrahovaly v poměru 50:50 metanol/voda, sonikovány 20 min a centrifugovány.
Chromatografie: mobilní fáze A = 10 mM amonný acetát pH 6,7, B = 50:50 methanol/acetonitril, gradient 20→52 % B (0–9 min), 52→85 % B (10,5 – 12,5 min), průtok 550 µL/min.
MS parametry: kapilární napětí 3 kV, konický napětí 35 V, teplota odplyňovacího plynu 400 °C (800 L/h), collision gas 0,15 mL/min, scan 100–700 amu, rychlost 5000 amu/s.
Survey Scan se spouštěním ScanWave MS a MS/MS při 25 a 35 eV pro neznámé komponenty.

Hlavní výsledky a diskuse

Všech pět vzorků bylo adulterováno:

• Vzorek 1: pouze tadalafil
• Vzorek 2: sildenafil
• Vzorek 3: sildenafil, tadalafil a další pravděpodobné analogie
• Vzorek 4: sildenafil a tadalafil
• Vzorek 5: strukturované analogy sildenafilu (není dostupný standard)

ScanWave umožnil jediným vstřikem detekci i identifikaci díky real-time přepínání mezi plnohodnotným MS scanem a MS/MS.
Diagnostické fragmenty pro sildenafil (m/z 377, 311, 283, 99), tadalafil (m/z 268, 262, 169, 135) a vardenafil (m/z 312, 299, 169, 99) potvrdily přítomnost API.
Vzorek 5 vykazoval neznámé amyloflurované analogy se společným fragmentem m/z 99 a novým iontem m/z 113.

Kvantitativní stanovení

Byly připraveny kalibrační křivky sildenafilu a tadalafilu 0,1–500 ng/mL na simulovaném extraktu (r2 > 0,9993).
Měřené koncentrace v jedné dávce vzorků 1–4 byly 0,08–116,7 mg sildenafilu a 13,5–52,1 mg tadalafilu, tedy na terapeutické úrovni.
Vzorek 5 nelze kvantifikovat kvůli absenci standardu pro analogy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou citlivost a selektivitu pro screening známých i neznámých adulterantů v komplexních maticích.
Vhodná pro kontrolu kvality a regulaci doplňků stravy a rychlou odezvu úřadů veřejného zdraví.
Usnadňuje rozhodnutí o dalším potvrzujícím testování a minimalizuje časové a materiálové nároky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na high resolution MS pro identifikaci dosud neznámých analogů.
Integrace diodové a orbitrapové detekce pro multi-modal screening.
Využití neřízeného a datově řízeného profilování podporované strojovým učením pro rychlejší odhalování skrytých adulterantů.
Vývoj interních databází fragmentačních vzorů a automatizovaných rutin pro strukturování nových analogických látek.

Závěr

Systém UPLC s tandemovou MS Xevo TQ MS s funkcí Survey Scan a ScanWave nabízí efektivní workflow pro detekci, identifikaci i kvantifikaci syntetických PDE5 inhibitorů v bylinných doplňcích.
Metoda pokrývá známé API i dosud neznámé analogy v jediném analytickém běhu a minimalizuje potřebu dodatečných experimentů.
Je ideálním nástrojem pro laboratoře zaměřené na QA/QC, regulaci potravinových doplňků a forenzní analýzy.

Reference

1. Koh HL, Woo SO. Chinese proprietary medicine in Singapore: regulatory control of toxic heavy metals and undeclared drugs. Drug Saf. 2000;23(5):351–362.
2. Huang WF, Wen KC, Hsiao ML. Adulteration by synthetic therapeutic substances of traditional Chinese medicines in Taiwan. J Clin Pharmacol. 1997;37(4):344–350.
3. Bogusz MJ et al. Application of LC-ESI-MS-MS for detection of synthetic adulterants in herbal remedies. J Pharm Biomed Anal. 2006;41(2):554–564.
4. Lau AJ et al. Analysis of adulterants in a traditional herbal medicinal product using LC-MS-MS. J Pharm Biomed Anal. 2003;31(2):401–406.
5. Gratz SR, Flurer CL, Wolnik KA. Analysis of undeclared synthetic PDE5 inhibitors in dietary supplements by LC-ESI-MS and LC-UV. J Pharm Biomed Anal. 2004;36(3):525–533.
6. Liang Q et al. Rapid determination of illegal adulterant in herbal medicines by LC/MS/MS. J Pharm Biomed Anal. 2006;40(2):305–311.
7. Reepmeyer JC, Woodruff JT. Detection and structure elucidation of novel vardenafil designer drug in herbal supplement. J Chromatogr A. 2006;1125(1):67–75.
8. Zou P et al. Simultaneous determination of synthetic PDE5 inhibitors in dietary supplements using HPLC-DAD and LC-ESI-MS/MS. J Chromatogr A. 2006;1104(1–2):113–122.
9. Reepmeyer JC, Woodruff JT. Structure elucidation of new sildenafil analogue in herbal supplement. J Pharm Biomed Anal. 2007;44(4):887–893.
10. Venhuis BJ et al. Designer drugs in herbal aphrodisiacs. Forensic Sci Int. 2008;177(2–3):e25–e27.
11. Ge X et al. Structural elucidation of PDE-5 inhibitor adulterant in health supplement. J Pharm Biomed Anal. 2008;48(4):1070–1075.
12. Lam YH et al. Identification of novel vardenafil analogue in herbal product. J Pharm Biomed Anal. 2008;46(4):804–807.
13. Singh S et al. Trends in Anal Chem. 2009;28(1):1–?
14. Reepmeyer JC, d’Avignon DA. Structure elucidation of thioketone analogues of sildenafil in herbal aphrodisiacs. J Pharm Biomed Anal. 2009;49(1):145–150.
15. Zou P et al. Isolation and identification of thiohomosildenafil and thiosildenafil in supplements. J Pharm Biomed Anal. 2008;47(2):279–284.
16. Venhuis BJ et al. Structure elucidation of thiono analogue of sildenafil in herbal aphrodisiac. J Pharm Biomed Anal. 2008;46(4):814–817.
17. Twohig M et al. Improving MS/MS Sensitivity using Xevo TQ MS with ScanWave. Waters Corp. 2008;720002828en.
18. DeBusk RF, Kloner RA. Rationale for not combining nitrates and PDE5 inhibitors. J Family Pract. 2005;Dec.