Exploring Factors That Influence Charge Variant Analysis of mAbs with Shim-pack Bio IEX Columns using Salt Gradient Elution

Význam tématu

Proteinová terapeutika, zejména monoklonální protilátky (mAbs), se široce využívají pro léčbu mnoha onemocnění. Precizní analýza jejich nabíjecích variant je klíčová pro odhalení posttranslačních modifikací (deamidace, glykozylace, oxidace, C terminální lysinová odejmutí), které mohou ovlivnit účinnost a bezpečnost produktu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo optimalizovat analytické podmínky pro separaci nabíjecích variant trastuzumabu pomocí silně kationtové výměnné chromatografie (CEX) se solným gradientem na sloupcích Shim-pack Bio IEX SP-NP. Studie zkoumala vliv parametrů gradientu, průtoku, délky a velikosti částic sloupce na rozlišení variant.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Shimadzu Nexera Bio s nevodivou průtokovou cestou
• Sloupec Shim-pack Bio IEX SP-NP (silně kationtový, sulfopropyl), délka 50 a 100 mm, vnitřní průměr 4,6 mm, velikost částic 3 µm a 5 µm
• Detekce UV při 280 nm

Metodika

Vzorek trastuzumabu byl ředěn na 5 mg/ml vodou a přímo injikován (objem 2 µl). Mobilní fáze A byla 20 mmol/l fosfátový pufr pH 6, fáze B obsahovala navíc 250 mmol/l NaCl. Separace probíhala gradientně od 0 do 250 mmol/l NaCl při 25 °C a průtoku 0,6 ml/min. Optimalizace zahrnovala:

• sklon solného gradientu (rychlý vs pomalý gradient),
• délku gradientu (5–20 min),
• průtok (0,4–0,8 ml/min),
• délku sloupce (50 vs 100 mm),
• velikost částic (3 vs 5 µm).

Hlavní výsledky a diskuse

Pomalý solný gradient zvýšil retenci a zlepšil rozlišení kyselých a bazických variant oproti hlavnímu píku. Prodloužení gradientního času vedlo k lepší identifikaci nízkoabundantních variant, avšak nadměrné prodloužení způsobovalo rozšíření píků. Změna průtoku neměla výrazný dopad na rozlišení, což vyplývá z neporézní struktury částic, kde interakce probíhají na povrchu. Zvýšení délky sloupce na 100 mm významně zlepšilo rozlišení oproti krátkému sloupci 50 mm. Velikost částic měla pouze menší vliv na kvalitu separace, zatímco menší částice zvyšovaly zpětný tlak.

Přínosy a praktické využití metody

Tato metoda umožňuje robustní a vysoce rozlišovací analýzu nabíjecích variant mAbs v rámci vývoje a kontroly kvality bioterapeutik. Díky variabilitě parametrů lze ji snadno přizpůsobit různým mAb produktům.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zdokonalování materiálů stacionární fáze, nové typy výměnných ligandů a integrace MS detekce pro podrobnou charakterizaci variant. Automatizace a online metody mohou zvýšit throughput a reproducibilitu analýz.

Závěr

Optimalizace parametrů solného gradientu, délky gradientu a délky sloupce na systému UHPLC Shimadzu Nexera Bio se sloupcem Shim-pack Bio IEX SP-NP výrazně zlepšila separaci nabíjecích variant trastuzumabu. Průtok a velikost částic měly omezený vliv, což usnadňuje přenos metody mezi laboratorními nastaveními.

Reference

1. Vlasak J., Ionescu R., Current Pharmaceutical Biotechnology, 2008, 9(6), 468-481.