Charge Variant analysis of mAb Biosimilars by Nexera UHPLC with a Shim-pack Bio IEX Column

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) patří k nejrozšířenějším bioterapeutikům s širokým využitím v diagnostice a klinické praxi. Vývoj biosimilárních verzí mAb přináší významné úspory nákladů, ale zároveň vyžaduje detailní charakterizaci kvality. Post-translační modifikace, jako je sialylace, deamidace, glykosylace nebo odštěpení C-koncových zbytků, vedou k odchylkám v rozdělení náboje, které mohou ovlivnit biologickou aktivitu a stabilitu léčiva.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie porovnává dvě iontově chromatografické metody na Shimadzu Nexera UHPLC pro analýzu nabitých variant bevacizumabového biosimiláru: konvenční salt-gradientní IEX a pH-gradientní IEX. Cílem bylo vyhodnotit rozlišení, rychlost analýzy a reprodukovatelnost obou přístupů.

Použitá metodika a instrumentace

• UHPLC systémy: Nexera-i UHPLC a Nexera Bio UHPLC (Shimadzu)
• Kolona: Shim-pack Bio IEX SP-NP (4,6 × 100 mm; 3 µm)
• Detektor: UV při 280 nm
• Salt-gradientní eluce: mobilní fáze A (voda), B (1 mol/L NaCl), C (40 mmol/L NaH2PO4), D (50 mmol/L Na2HPO4); průtok 0,6 mL/min; gradientní program 0–5 min pro efektivní oddělení
• pH-gradientní eluce: mobilní fáze A (10 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4, pH 6), B (10 mmol/L NaHCO3/Na2CO3, pH 10); průtok 0,6 mL/min; pH-gradientní program 0–12 min
• Vzorek: 5 mg/mL bevacizumabový biosimilár v 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)

Hlavní výsledky a diskuse

• Salt-gradient IEX dosáhl rozlišení nabitých variant během 5 minut, s hlavním vrcholem ~50,99 %, kyselými ~34,94 % a bazickými ~14,07 %. Reprodukovatelnost retenčních časů <1 % RSD a ploch <2 % RSD.
• pH-gradient IEX oddělil varianty za 12 minut, s hlavním vrcholem ~67,30 %, kyselými ~23,25 % a bazickými ~9,45 %. Rovněž RSD retenčních časů <1 % a ploch <2 %.
• Rozdíly v relativním zastoupení variant vyplývají z odlišné eluční mechaniky: v salt-gradientu Na+ konkuruje o iontově-výměnné místo, v pH-gradientu mAb eluují při dosažení izoelektrického bodu.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazná rychlost a přesnost pro rutinní kontrolu kvality mAb biosimilár.
• Možnost aplikace na široké spektrum monoklonálních protilátek s minimální úpravou metody.
• Flexibilita volby elučního protokolu podle požadavků na rozlišení nebo dobu analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pH-gradientních metod do automatizovaných vysoce propustných linek pro QC laboratoře.
• Spolupráce s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci strukturálních variant.
• Rozšíření paradigmatu na další biologické makromolekuly a multiplexní analýzy.

Závěr

Obě popsané IEX metody (salt-gradient a pH-gradient) na systému Nexera UHPLC prokázaly vysoké rozlišení, robustnost a vynikající reprodukovatelnost při analýze nabitých variant bevacizumabového biosimiláru. Výběr mezi nimi závisí na preferencích rychlosti versus universality aplikace metody.

Reference

• Farnan D, Moreno GT. Multiproduct high-resolution monoclonal antibody charge variant separations by pH gradient ion-exchange chromatography. Anal Chem. 2009;81(21):8846–57.