How Shallow Can You Go? - Refining charge variant analysis of mAbs with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System

Význam tématu

Analýza nabitých variant monoklonálních protilátek je klíčová pro zajištění bezpečnosti a účinnosti biofarmaceutik. Monoklonální protilátky jsou velké heterogenní makromolekuly s řadou posttranslačních modifikací, které mohou ovlivnit jejich biologickou aktivitu, stabilitu a imunitní reakci. Spolehlivá separace a kvantifikace těchto variant je proto nezbytná v průběhu vývoje i kontroly kvality léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo optimalizovat analýzu nabitých variant tráztuzumabu a referenčního standardu NISTmAb pomocí systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC. Studie porovnávala různé slopové solné gradienty z hlediska rozlišení jednotlivých variant a reprodukovatelnosti naměřených dat.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda byla založena na iontově výměnné chromatografii při pH 6,8 s velmi mělkými solnými gradienty NaCl (0–150 mM) v čase 30–31 minut. Instrumentace zahrnovala:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC High-Speed Pump s bezželezným průtokem
• Agilent 1290 Infinity II Bio Multisampler s termostatem
• Agilent 1290 Infinity II Multicolumn Thermostat s biokompatibilním výměníkem tepla
• Agilent 1290 Infinity II Variable Wavelength Detector (biokompatibilní mikrobuněčka)
• Kolona Bio MAb NP5, 2,1 × 250 mm, PEEK

Pro přípravu pufrů byly použity fosfátové soli, NaCl a běžné reagenční látky v kvalitě LC grade. Všechny roztoky byly filtrované na 0,2 μm.

Hlavní výsledky a diskuse

Při testování široké škály gradientních slopů bylo zjištěno, že nejméně prudké gradienty (např. 0,83 mM/min) vedou ke značnému rozšíření peaků bez výrazného zvýšení rozlišení. Optimální kompromis mezi ostrostí a rozlišením poskytly gradienty 3,3 mM/min pro tráztuzumab a 2,5 mM/min pro NISTmAb. Reprodukovatelnost retence variant byla v těchto podmínkách vynikající (RSD < 0,06 % pro RT) a přesnost plochy pod 1 % RSD. Dokonce i supermělký gradient 0,83 mM/min přinesl RT RSD < 0,25 %, což dokládá vysokou přesnost čerpadla.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá separace nabitých variant monoklonálních protilátek.
• Odolnost proti korozivním solným pufrům díky bezželeznému průtoku.
• Vysoká reprodukovatelnost vhodná pro QC a vývoj bioterapeutik.
• Možnost aplikace na široké spektrum proteinových produktů a biosimilárů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci modifikací na úrovni aminokyselin.
• Automatizovaná optimalizace gradientů za pomoci strojového učení.
• Rozšíření metod na další třídy biologických makromolekul a proteomické aplikace.
• Miniaturizace a akcelerace analýz pro vysokou propustnost v QC laboratořích.

Závěr

Systém Agilent 1290 Infinity II Bio LC prokázal schopnost spolehlivě pracovat s velmi mělkými solnými gradienty a korozivními pufry, a to s vynikajícím rozlišením i reprodukovatelností. Díky robustnímu designu s bezželezným průtokem představuje ideální nástroj pro detailní charakterizaci nabitých variant monoklonálních protilátek.

Reference

• [1] Dick Jr. L. W.; et al. Identification and Measurement of Isoaspartic Acid Formation in the Complementarity Determining Region of a Fully Human Monoclonal Antibody. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2009, 877(30), 3841–3849.
• [2] Zhang L.; et al. Improving pH Gradient Cation-Exchange Chromatography of Monoclonal Antibodies by Controlling Ionic Strength. J. Chromatogr. A 2013, 1272, 56–64.
• [3] Farnan D.; Moreno G. T. Multiproduct High-Resolution Monoclonal Antibody Charge Variant Separations by pH Gradient Ion-Exchange Chromatography. Anal. Chem. 2009, 81(21), 8846–8857.
• [4] The LC Handbook Guide to LC Columns and Method Development. Agilent Technologies, publication number 5990-7595EN, 2016.
• [5] Goyon A.; et al. Determination of Isoelectric Points and Relative Charge Variants of 23 Therapeutic Monoclonal Antibodies. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2017, 1065–1066, 119–128.
• [6] Xie L.; et al. Demonstrating Analytical Similarity of Trastuzumab Biosimilar HLX02 to Herceptin with a Panel of Sensitive and Orthogonal Methods Including a Novel FcγRIIIa Affinity Chromatography Technology. BioDrugs 2020, 34(3), 363–379.