Convenient Customization of Your Cation Exchange Analysis

Význam tématu

Analýza nabitých variant monoklonálních protilátek je klíčová pro charakterizaci jejich mikroheterogenity a zajištění bezpečnosti a účinnosti biofarmaceutik. Tradiční iontově-výměnná chromatografie se často spoléhá na soli, jejichž optimalizace může být časově náročná a citlivá na změny parametrů. Metoda založená na pH gradientu přináší větší rozlišovací schopnost a robustnost separace, usnadňuje vývoj metod a snižuje riziko modifikací proteinů vlivem kovových iontů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem application note bylo demonstrovat využití pH gradientů pro vysoce rozlišující analýzu nabitých variant dvou monoklonálních protilátek, trastuzumabu a referenčního NIST mAb. Použit byl systém Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC s bezželeznou cestou průtoku a software Agilent Buffer Advisor. Studie porovnávala klasické solné gradienty s pH gradienty a dále rozšířila metodiku pro široký pH rozsah dle Farnana a Morena.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separace byla použita kolona Bio MAb NP5 (2,1×250 mm) v kombinaci s Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC System, skládajícím se z Bio Flexible Pump, Bio Multisampler, Multicolumn Thermostat a Variable Wavelength Detector s biokompatibilní kapilárou MP35N. Dynamické míchání pufrů zajišťoval Buffer Advisor, který generoval solné i pH gradienty z pouhých čtyř základních roztoků. Jako vzorky sloužily trastuzumab ve fosfátovém pufru pH 6,8 a NISTmAb. Pufry byly připraveny podle receptur v Buffer Advisor: fosfátový systém pro solné i pH gradienty a kompozitní širokopásmový pH gradient dle Farnan–Moreno.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání solného a fosfátového pH gradientu ukázalo srovnatelnou separaci trastuzumabu s mírně lepší rozlišovací schopností u pH gradientu. Funkce Optimize Gradient ve Buffer Advisor zajistila vysokou lineárnost pH změny bez odchylek přes 0,1 pH jednotky. Reprodukovatelnost sedmi po sobě jdoucích injekcí byla vynikající (RSD retenčních dob < 0,09 %, RSD ploch < 1 %). Široký pH gradient (8,3–10,0) dále odhalil šest kyselých a čtyři bazické varianty trastuzumabu s ostrými a dobře rozlišenými píky (RSD RT < 0,06 %, RSD ploch < 1,7 %), kde solný gradient nedosahoval stejné kapacity. Upravený pH rozsah 8,9–10,5 umožnil separaci tří kyselých a dvou bazických variant NISTmAb.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda založená na pH gradientu výrazně zjednodušuje vývoj separací nabitých variant mAb díky univerzálnosti pufrování a dynamickému míchání roztoků v Buffer Advisor. Eliminuje dlouhé přípravy pufrů a přináší vyšší rozlišovací schopnost než klasické solné gradienty. Kompletně bezželezná cesta průtoku minimalizuje riziko korozních a oxidačních modifikací bílkovin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj softwarových nástrojů pro automatizovanou optimalizaci gradientů, integrace do platforem pro procesní analytickou technologii (PAT) a rozšíření aplikace na další biologické makromolekuly. Kombinace pH gradientů s masovou spektrometrií nebo multiatributovou analýzou může přinést komplexní pohled na kvalitu bioterapeutik.

Závěr

pH gradienty nasazené na Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC System s Buffer Advisor poskytují vysoce rozlišující, reprodukovatelné a univerzální metody pro separaci nabitých variant monoklonálních protilátek. Širokopásmové pH gradienty dále rozšiřují aplikační možnosti pro různé protilátky s vysokými pI.

Reference

• Farnan D.; Moreno G. T. Multiproduct High-Resolution Monoclonal Antibody Charge Variant Separations by pH Gradient Ion-Exchange Chromatography. Anal. Chem. 2009, 81(21), 8846–8857.
• Liu H.; et al. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. J. Pharm. Sci. 2008, 97, 2426–2447.
• Vlasak J.; Ionescu R. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies Revealed by Charge-Sensitive Methods. Curr. Pharm. Biotechnol. 2008, 9, 468–481.
• Rea J.; et al. Validation of a pH Gradient-Based Ion-Exchange Chromatography Method for High-Resolution Monoclonal Antibody Charge Variant Separations. J. Pharm. Biomed. Anal. 2011, 54, 317–323.
• Lingg N.; et al. Highly Linear pH Gradients for Analyzing Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity in the Alkaline Range: Validation of the Method Parameters. J. Chromatogr. A 2014, 1373, 124–130.
• Turner A.; Schiel J. E. Qualification of NISTmAb Charge Heterogeneity Control Assays. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410(8), 2079–2093.
• Schneider S. How Shallow Can You Go? Refining Charge Variant Analysis of mAbs with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System. Agilent Technologies App. Note 5994-2692EN 2020.