Separation and Analysis of Polysorbate 80 in the Presence of Human Serum Immunoglobulin G Using Agilent Bond Elut Lipid Extraction SPE Cartridges

Význam tématu

Polysorbát 80 je klíčový neiontový surfaktant používaný k ochraně biotherapeutických proteinů proti agregaci a adhezi na povrchy. Kontrola jeho obsahu a stability je zásadní pro zajištění kvality finálního produktu a prevenci tvorby částic vyvolaných degradačními procesy jako je oxidace a hydrolýza.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikované poznámky bylo vyvinout rychlou a spolehlivou metodu separace, stanovení a kvantifikace PS 80 jak v naředěných vodných roztocích, tak v roztocích lidského séra s imunoglobulinem G. Studie se zaměřila na optimalizaci přípravy vzorku pomocí Agilent Bond Elut Lipid Extraction SPE kartridží a na vyhodnocení analytických parametrů při detekci LC/DAD a LC/ELSD.

Použitá metodika

Vzorky byly zpracovány přes SPE kartridže s EMR-Lipid sorbentem. Pracovní postup zahrnoval:

• přepírání kartridže acetonitrilem a vodou
• naložení vzorku v čistém pufru či vodě
• odplavení nevyvázaných látek vodou
• eluci PS 80 z kartridže směsí 80 % acetonitrilu ve vodě

Eluát se analyzoval metodami LC/DAD a LC/ELSD. Kvantifikace vycházela z celkové plochy piků v definovaných retenčních oknech.

Použitá instrumentace

Pro stanovení byly použity tyto přístroje a materiály:

• Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC s PDA a ELSD detektory
• Agilent Bond Elut Lipid Extraction SPE kartridže, 1 mL
• InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 kolony (3,0×50 mm a 3,0×100 mm)
• OpenLab nebo ChemStation software pro řízení LC systémů
• Reagencie a rozpouštědla anal. kvality včetně formiové a fosforečné kyseliny

Hlavní výsledky a diskuse

Obě detekční metody prokázaly vysokou linearitu (R2>0,99) v definičních rozsazích. LOD metody LC/DAD činilo 0,1 mg/mL, LOQ 0,2 mg/mL. ELSD detekce byla citlivější s LOD 0,03 mg/mL a LOQ 0,04 mg/mL. Přesnost kvantifikace se pohybovala mezi 86 a 106 %, opakovatelnost měření (RSD) byla do 6 %. Metody nejeví významné interferenční píků v bodech eluce PS 80, ani při přítomnosti IgG.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup umožňuje selektivní odstranění proteinové matrice a přesné stanovení PS 80 v různých typech vzorků biopharmy. Metoda nabízí snadnou přípravu vzorku a možnost volby mezi rychlejší DAD a citlivější ELSD detekcí v závislosti na požadované citlivosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodika se dá rozšířit na další neiontové surfaktanty jako PS 20, Triton X-100 nebo poloxamery. Další vývoj může směřovat k integraci s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci degradačních produktů a k zavedení automatizovaných modulů pro vysokopropustné zpracování vzorků.

Závěr

Agilent Bond Elut Lipid Extraction SPE kartridže v kombinaci s LC/DAD a LC/ELSD detekcí poskytují robustní, citlivý a specifický analytický postup pro kvantifikaci PS 80 v biopharmaceutických matrixech. Metoda splňuje požadavky na přesnost, opakovatelnost a rozsah stanovení pro rutinní kontrolu kvality.

Reference

• Martos A et al. Trends on Analytical Characterization of Polysorbates and Their Degradation Products, Journal of Pharmaceutical Sciences 2017
• Koppolu V et al. A Universal Method for the Determination of Polysorbate 80 in Monoclonal Antibodies and Novel Protein Therapeutic Formulations, Analytical Methods 2018
• Khan TA Mahler HC Kishore RSK Key Interactions of Surfactants in Therapeutic Protein Formulations, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2015
• Fekete S Ganzler K Fekete J Fast and Sensitive Determination of Polysorbate 80 in Solutions Containing Proteins, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2010
• Honemann MN et al. Monitoring Polysorbate Hydrolysis in Biopharmaceuticals Using a QC-ready Free Fatty Acid Quantification Method, Journal of Chromatography B 2019
• Dahotre S et al. Novel Markers to Track Oxidative Polysorbate Degradation in Pharmaceutical Formulations, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2018
• Hvattum E et al. Characterization of Polysorbate 80 with LC-MS and NMR Spectroscopy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2012
• Yu J et al. Analysis of Tween 80 by HPLC with Diode Array Detection, Agilent Application Note 2018
• Fukuda J et al. Utilization of a Precolumn with Size Exclusion and Reversed-Phase Modes for SEC Analysis of Polysorbate-Containing Protein Aggregates, Journal of Chromatography B 2014
• Zhao L Quantitative Determination of Drugs of Abuse in Human Whole Blood by LC-MS-MS Using Agilent Captiva EMR-Lipid Cleanup, Agilent Technologies 2018
• Zhao L et al. Multi-class Multi-residue Analysis of Pesticides in Edible Oils by GC-MS-MS Using Liquid-Liquid Extraction and EMR Cleanup, Journal of Chromatography A 2019
• Apffel A Zhao L Lipidomic Analysis of Human Plasma using Bond Elut Lipid Extraction with Agilent 6545 LC-Q-TOF, Agilent Technologies 2020