A high-resolution accurate mass multi-attribute method for critical quality attribute monitoring and new peak detection

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčové biologické léčivé látky. Diagnostika a kontrola kvality těchto proteinů vyžaduje spolehlivou analýzu kritických kvalitativních atributů (CQAs). Metoda HRAM MAM spojuje vysoké rozlišení a přesnou hmotnost pro komplexní sledování přídatných modifikací, glykozylací a neočekávaných impurit během vývoje a uvolňování šarží.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout workflow pomocí Orbitrapového MS a UHPLC pro kvantitativní sledování CQAs NISTmAb standardu zahrnujících glykozylaci, deamidaci, isomerizaci, oksidaci, pyroglutamát, trhání C-terminálního lyzinu a glykaci. Dále byla demonstrována schopnost detekce nových špiček (NPD) ve stresovaných a PRTC dopovaných vzorcích.

Použitá metodika a instrumentace

• UHPLC separace s Vanquish Horizon a Accucore Vanquish C18+ kolony
• Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS
• Automatizované ovládání a analýza v Chromeleon 7.2.10 CDS a BioPharma Finder 3.1
• Příprava vzorků: redukce DTT, alkylace jodacetamidem, tryptická digestce
• Podmínky stresu: termální (60 °C, 120 h) a oxidační (0,03% H2O2, 24 h)

Hlavní výsledky a diskuse

• Kompletní sekvenční pokrytí (>96%) umožnilo robustní mapování CQAs
• Vysoké rozlišení (140 000 @ m/z 200) oddělilo izotopy deamidovaných a nativních peptidů
• Metoda demonstrovala reprodukovatelnost poměrů CQAs v technických a biologických replikátech
• Stresové studie ukázaly nárůst deamidace až 13× a isomerizace >60× při termálním stresu
• Oxidační stres vedl k významnému nárůstu oxidace methioninu (2–14 %)
• NPD odhalila všechny dopované PRTC peptidy s poměrem >1000× a neočekávané modifikace ve stresovaných vzorcích

Přínosy a praktické využití metody

• Integrace detekce, kvantifikace CQAs a NPD v jednom pracovním postupu
• Možnost nahradit několik konvenčních metod QC jedinou HRAM MAM
• Kompatibilita s GMP díky uzamknutelným metodám v Chromeleon CDS

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow pro další proteinové bioterapeutika
• Implementace automatizované NPD s pokročilými filtry pro vyšší citlivost
• Využití strojového učení pro predikci a klasifikaci CQAs
• Integrace do online monitoringu procesů (PAT) a Quality by Design (QbD)

Závěr

Workflow HRAM MAM s Q Exactive Plus a Vanquish UHPLC nabízí vysokou specifitu, citlivost a reprodukovatelnost pro komplexní monitoring CQAs a NPD v monoclonálních protilátkách. Díky seamless integraci softwaru BioPharma Finder a Chromeleon je metoda vhodná pro vývoj i rutinní QC v souladu s regulačními požadavky.

Reference

1. Rogers R et al. Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics. MAbs 2015;7:881
2. Rogers R et al. A view on the importance of multi-attribute method for measuring purity of biopharmaceuticals and improving overall control strategy. AAPS J 2018;20:7
3. Li WZ et al. Structural elucidation of post-translational modifications in monoclonal antibodies. State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization 2015;2:119
4. Ren D et al. An improved trypsin digestion method minimizes digestion-induced modifications on proteins. Anal Biochem 2009;392:12