Refinement of HR Multi-Attribute Method from Sample Preparation to Data Analysis

Význam tématu

Metoda HR Multi-Attribute Method (HR MAM) založená na Orbitrap technologii s vysokým rozlišením a přesnou hmotností umožňuje v biopharmaceutickém průmyslu sledovat kritické kvalitativní atributy (CQA) a detekovat nové či neočekávané nečistoty (NPD) v jednom LC-MS měření. Díky robustnímu softwarovému zpracování přináší spolehlivou a opakovatelnou analýzu během vývoje i kontroly kvality terapeutických proteinů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem této studie bylo zdokonalit celý pracovní postup HR MAM od přípravy vzorku až po výslednou analýzu dat. Autoři porovnali různé přístupy k trávení, optimalizovali separační kolonky a ukázali nové funkce v Chromeleon CDS softwaru pro konzistentní detekci a integraci píků.

Použitá metodika a instrumentace

Pro trávení byla srovnána klasická in-solution metoda a automatizovaný nízkopH SMART Digest™ protokol na KingFisher™ Duo Prime systému řízeném BindIt™ softwarem. Separace peptidů probíhala na Vanquish™ Horizon UHPLC systému. Detekce a fragmentace využívala Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ spektrometr s nastavením rozlišení 140 000 (m/z 200). Data byla vyhodnocena v BioPharma Finder™ (peptidové mapování) a Chromeleon™ CDS (kvantitativní analýza a NPD).

Hlavní výsledky a diskuse

Proces nízkopH SMART Digest zkrátil čas trávení na méně než 1 hodinu (oproti ~2 hod. in-solution) při 100% sekvenčním pokrytí NISTmAb. Zvýšením množství trypsinových kuliček se snížil podíl chybějících štěpných míst. Test čtyř komerčních kolon (Accucore Vanquish, Acclaim Vanquish PA II, Hypersil GOLD, Accucore Vanquish) odhalil nejlepší separaci deamidovaných forem s Acclaim Vanquish PA II. Optimalizace S-Lens RF ilustrovala vliv na in-source fragmentaci glykofeptidů, což zdůrazňuje nutnost jemného doladění podmínek ionizace. Chromeleon CDS nabízí flexibilní nastavení RT oken, algoritmů detekce (ICIS, Genesis, Cobra) a vyhlazování pro stabilní integraci i náročných isomerizačních píků.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizované trávení vede k vyšší reprodukovatelnosti a nižší variabilitě mezi vzorky.
• Optimalizovaná separace zlepšuje kvantitativní rozlišení nativních a modifikovaných forem proteinů.
• Pokročilé softwarové nástroje usnadňují validovanou detekci a kvantifikaci kritických atributů i nových píků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metodiky může zahrnovat plnou automatizaci přípravy vzorku pomocí robotických platforem, rozšíření AI-podporovaných algoritmů pro analýzu NPD a adaptaci HR MAM na širší škálu biopharmaceutik, včetně konjugovaných protilátek a peptidů.

Závěr

Zefektivněný HR MAM workflow kombinuje rychlé a konzistentní trávení, pečlivou volbu kolon a výkonné softwarové nástroje, což poskytuje robustní platformu pro charakterizaci a kontrolu kvality terapeutických proteinů.

Použitá instrumentace

• KingFisher Duo Prime Purification System s nízkopH SMART Digest Kit
• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC
• Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Spectrometer
• BioPharma Finder Software verze 3.2
• Chromeleon Chromatography Data System verze 7.2.10

Reference

1. Liu HC et al. A high-resolution accurate mass multi-attribute method for critical quality attribute monitoring and new peak detection. Thermo Scientific Application Note 72916.
2. Rogers R et al. Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics. MAbs, 2015, 7, 881.
3. Rogers R et al. A view on the importance of “multi-attribute method” for measuring purity of biopharmaceuticals and improving overall control strategy. The AAPS Journal, 2018, 20, 7.
4. Rogstad S et al. Multi-attribute method for quality control of therapeutic proteins. Anal. Chem., 2019, 91, 14170.
5. Ren D et al. An improved trypsin digestion method minimizes digestion-induced modifications on proteins. Analytical Biochemistry, 2009, 392, 12.