LCMS Bioanalysis of Antibody Drugs Using Fabselective Proteolysis "nSMOL Method" - Part 6 - Improvement of Reaction Conditions for Automated Analyses -

Význam tématu

Metoda nSMOL umožňuje selektivní proteolýzu Fab-regionu monoklonálních protilátek pomocí imobilizovaného trypsinu na FG kuličkách. Tato inovační technologie zjednodušuje a zpřesňuje LC-MS bioanalýzu protilátek v biologických matricích, což je klíčové pro spolehlivé farmakokinetické studie a klinický monitoring léčby.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo optimalizovat reakční podmínky nSMOL metody tak, aby proteolýza probíhala bez kontinuálního protřepávání, a validovat statický protokol podle japonské směrnice pro bioanalytické metody, která je srovnatelná s požadavky na malé molekuly.

Použitá metodika a instrumentace

Protokol nSMOL zahrnuje:

• Imunokapturaci IgG na pryskyřici s póry 100 nm
• Odmytí nežádoucích složek z matrice
• Přidání nanopartiklí FG (200 nm) s imobilizovaným trypsinem
• Proteolýzu po počátečním 10s protřesení bez dalšího pohybu
• Zastavení reakce inhibičním roztokem a odstranění částic spinfiltrací

Analýza LC-MS probíhala na systému Shimadzu Nexera X2 spojeném s triplekvadrupólem LCMS-8050. Použitá kolona byla Shim-pack GISS C18 (50×2.1 mm, 1.9 µm) při 50 °C, gradient z 1 na 25 % acetonitrilu ve formiátové kyselině, průtok 0.4 mL/min, objem injekce 10 µL. MS parametry zahrnovaly ESI pozitivní ionizaci, DL 250 °C, blokový ohřívač 400 °C, rozhraní 300 °C, plyn nebulizéru 3 L/min, sušící plyn 10 L/min a ohřívací plyn 10 L/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání statického a kontinuálního režimu u trastuzumabu, bevacizumabu, rituximabu a nivolumabu prokázalo: statický režim dosáhl 84,6 % účinnosti u trastuzumabu a 95,7–102 % u ostatních protilátek vzhledem k 100% referenční hodnotě při neustálém protřepávání. Validace statického protokolu pro koncentrace 0.1–300 µg/mL ukázala přesnost 95–104 % a variabilitu (%CV) pod 15 %, což odpovídá požadavkům směrnice.

Přínosy a praktické využití metody

Eliminace potřeby specializovaného shakeru zjednodušuje workflow v laboratoři, snižuje náklady a prostorové nároky. Statický nSMOL protokol je kompatibilní s automatizovanými platformami, vhodný pro vysokoprokročilé bioanalytické aplikace v preklinickém i klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále rozšířit na vysokoprostorový screening vzorků, plně automatizované roztoky pro farmaceutické a biotechnologické laboratoře a aplikovat ji na nové formy protilátek, jako jsou bispecifické protilátky nebo protilátkové konjugáty. Integrace s vysoce výkonnými hmotnostními spektrometry zvýší citlivost a propustnost.

Závěr

Statický režim nSMOL metody poskytuje srovnatelnou účinnost a validaci jako konvenční protokol s protřepáváním. Umožňuje zjednodušenou, bezpečnou a automatizovatelnou LC-MS analýzu protilátek s vysokou přesností a opakovatelností.

Reference

• Iwamoto N et al., Analyst, DOI:10.1039/c3an02104a
• Iwamoto N et al., Anal Methods, DOI:10.1039/C5AY01588J
• Iwamoto N et al., Drug Metab Pharmacokinet, DOI:10.1016/j.dmpk.2015.11.004
• Iwamoto N et al., Biol Pharm Bull, DOI:10.1248/bpb.b16-00230
• Iwamoto N et al., J Chromatogr B, DOI:10.1016/j.jchromb.2016.04.038