Investigation of Human Embryo Culture Media Using a Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza složení kultivačních médií pro lidské embrya je klíčová pro zajištění optimálních podmínek při in vitro fertilizaci (IVF). Kvalita živného prostředí přímo ovlivňuje vývoj embryí a úspěšnost asistované reprodukce. Vědomí obsahu energetických substrátů, aminokyselin, antioxidantů a dalších přísad umožňuje v laboratořích standardizovat a kontrolovat kvalitu médií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat metodiku založenou na vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrii typu Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) pro identifikaci organických sloučenin v třech komerčních médiích: Early Cleavage Medium (ECM), Multi Blast Media (MBM) a Continuous Single Culture-NXC (CSCM-NXC). Výzkum se zaměřil na detekci energetických substrátů, aminokyselin, antioxidantů a pH indikátorů pomocí přesné hmotnosti a knihovny MS/MS spekter.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci látek byla použita:

• UHPLC systém LC-30A
• HRMS spektrometr Shimadzu LCMS-9030 (Q-TOF)
• ionizace ESI v módech pozitivním a negativním
• Data Dependent Acquisition s rozsahem skenování m/z 10–600 pro MS a 50–600 pro MS/MS
• 96standardní sloučeninová knihovna pro potvrzení složek
• předčištění vzorku odvětráváním proteinů (centrifugace při 15 000 rpm, 4 °C)

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza odhalila výrazné rozdíly v obsahu třech médií:

• ECM obsahovalo především základní energetické substráty (glukóza, pyruvát, laktát), taurinu a fenol red jako pH indikátor.
• MBM vykazovalo kromě substrátů přítomnost celé řady esenciálních i neesenciálních aminokyselin (např. alanin, arginin, asparagin, glutamát, leucín, isoleucín) a antioxidant citrát.
• CSCM-NXC, určené pro kontinuální kultivaci, obsahovalo nejširší spektrum aminokyselin, alanyl-glutamin, citrát, ale postrádalo fenol red.

Chromatogramy prokázaly schopnost Q-TOF rozlišit izomery, například leucín a isoleucín, díky rozdílným fragmentačním vzorcům v MS/MS knihovně.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a spolehlivou identifikaci klíčových metabolitů v embryonálních médiích, podporuje kontrolu kvality výroby a vývoj nových složení. Díky schopnosti rozeznat izomery se zvyšuje přesnost analýzy složitých směsí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Zavedení cílené kvantifikace pomocí MRM, rozšíření knihovny o nové metabolity, integrace s metabolomickými přístupy a real-time monitoring změn v průběhu kultivace embryí představují další kroky. Populárními směry jsou též vysokopropustné metody a automatizace přípravy vzorků.

Závěr

Vyvinutá procedura s použitím LCMS-9030 umožňuje detailní profilování organických složek v médiích pro lidské embrya. Rozdíly v obsazích jednotlivých médií podtrhují význam přizpůsobení složení potřebám různých fází embryonálního vývoje.

Reference

• Biggers JD. Fundamentals of the design of culture media that support human preimplantation development. In: Van Blerkom J, ed. Essential IVF. Norell, MA: Kluwer Academic Press; 2003:291–332.