Qualitative Characterization and Quantitative Assessment of Monoclonal Antibodies Using Protein Metrics and nSMOLcoupled with the Shimadzu LCMS-9030 QTOF

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou třídu bioterapeutik používaných v onkologii, autoimunitních onemocněních i dalších terapiích. Precizní charakterizace intactní molekuly, jejích podjednotek a post-translačních modifikací (např. glykozylace) je nezbytná pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a konzistence výrobních šarží. Současně citlivá kvantifikace mAb v biologické matrici podporuje farmakokinetické, farmakodynamické studie a terapeutický monitoring.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ukázat kombinaci špičkového Q-ToF spektrometru Shimadzu LCMS-9030 s analytickým softwarovým řešením Protein Metrics a protolytickou technologií nSMOL. Studie zahrnovala:

• Kvalitativní charakterizaci intaktního NIST mAb standardu a jeho podjednotek (heavy chain, light chain).
• Mapování peptidů po trávení různými proteázami (trypsin, Lys-C, Glu-C).
• Analýzu glykovarint pomocí PNGase F deglycosylace.
• Kvantitativní stanovení bevacizumabu v lidském séru metodou MRM s nSMOL.

Použitá instrumentace

• UHPLC Shimadzu Nexera X2
• Q-ToF hmotnostní spektrometr Shimadzu LCMS-9030
• LC-30AD x2 pumpy, DGU-20A5R online odplyňovač, SIL-30AC MP autosampler
• CTO-20AC termostat kolony, CBM-20A řídicí modul
• Softwarové prostředí LabSolutions Ver. 5.95

Použitá metodika

• Příprava intaktního mAb: 1 mg/mL v 50 mM amonium uhličitanu, redukce DTT, alkylace IAA.
• Trávení HC a LC subjednotek proteázami (trypsin, Lys-C, Glu-C) při poměru enzym:substrát 1:25.
• Deglycosylace heavy chain s PNGase F pro uvolnění N-glykánů.
• Analýza intaktní molekuly, podjednotek a peptidových směsí s LCMS-9030 Q-ToF.
• nSMOL protolýza k cílenému trávení Fab oblasti a stanovení MRM tranzicí pro bevacizumab.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intaktní NIST mAb: dekonvoluovaná hmotnost plně souhlasila s teoretickými hodnotami (rozpětí Δm < 3,7 Da).
• Podjednotky HC/LC: detailní spektra odhalila hlavní glykovary G0F, G1F, G2F a jejich odštěpky (<2,5 Da odchylka).
• Peptidové mapování: celkové pokrytí sekvence různými proteázami, potvrzení klíčových post-translačních modifikací.
• Kvantifikace bevacizumabu: kalibrační křivka 100–10 000 ng/mL, přesnost <20 % na všech úrovních, korelační koeficient r2 = 0,998.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní a spolehlivé určení hmotnostních variant mAb včetně glykovarint.
• Vysoká citlivost a selektivita kvantifikace mAb v biologických vzorcích.
• Podpora vývoje a kontroly kvality bioterapeutik, PK/PD studií a TDM.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj nSMOL technologie a automatizace workflow pro vysokoprůtokové laboratoře.
• Integrace umělé inteligence a pokročilých algoritmů pro interpretaci hmotnostních dat.
• Multiplexní analýzy různých mAb v rámci jednoho běhu.

Závěr

Komplexní platforma Shimadzu LCMS-9030 Q-ToF v kombinaci se softwarem Protein Metrics a technologií nSMOL poskytuje robustní a citlivou cestu pro kvalitativní i kvantitativní analýzu monoklonálních protilátek. Tento přístup podporuje spolehlivé sledování bioterapeutik od vývoje až po klinickou aplikaci.

Reference

• Vikki Johnson, Stephen Kurzyneic. Qualitative Characterization and Quantitative Assessment of Monoclonal Antibodies Using Protein Metrics and nSMOL coupled with the Shimadzu LCMS-9030 QTOF.