Too Polar for Reversed Phase – What Do You Do?

Význam tématu

Analýza velmi polárních sloučenin v klasické reverzní fázi často selhává kvůli nízké retenci či kolapsu stacionární fáze (pore dewetting). Pochopení a aplikace alternativních chromatografických postupů je zásadní pro spolehlivou kvalitativní a kvantitativní analýzu v průmyslové i výzkumné praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Článek pojednává o omezeních tradičních C8/C18 kolón při analýze velmi polárních kyselin a bází a představuje řadu řešení: úpravu metodických podmínek, iontově-párovou chromatografii, volbu polar-modified stacionárních fází (phenyl, polar-embedded), normal fázi, HILIC a ligandovou výměnu (Hi-Plex).

Použitá metodika a instrumentace

Metody:

• Úprava pH mobilní fáze (pH >8) s použitím bidentátních C18 fází odolných v širokém rozsahu pH
• Iontově-párová chromatografie s alkylsulfonáty (hexansulfonát) nebo kvartérními aminy pro zvýšení retence ionizovatelných látek
• Volba polar-modified fází: phenyl-hexyl, Bonus-RP (polar-embedded), SB-Aq (stabilně vodná)
• Normal fáze na silice, cyano a diol stacionárních fázích pro extrémně polární analyty
• HILIC (silica, amide, diol) pro silně polární a nabité sloučeniny s vysokým podílem organického modifieru
• Ligandová výměna (Hi-Plex) na sulfonovaných styren-divinylbenzenových částicích

Instrumentace:

• LC systém Agilent 1200 series s Quaternary pumpou
• Diodový array detektor (DAD) a UV detekce při různých vlnových délkách
• Kolony: ZORBAX C8/C18 (Extend-C18), Phenyl-Hexyl, Eclipse Plus Phenyl, Bonus-RP, SB-Aq, Rx-SIL HILIC, Poroshell HILIC, Hi-Plex Ca/H

Hlavní výsledky a diskuse

C18 kolony při nízkém obsahu organiky vykazují nepředvídatelný pokles retence (phase collapse). Použití bidentátního end-capovaného Extend-C18 rozšiřuje pH stabilitu a udržuje reprodukovatelnost. Iontově-párová chromatografie poskytuje významné zlepšení retence polárních kyselin a bází, avšak vyžaduje precizní kontrolu IP činidla, pH, teploty a delší ekvilibraci. HILIC dosažením 70–90 % organického modifieru dramaticky zvyšuje retenci a zlepšuje tvary špiček základních a nabitých molekul, navíc zvyšuje citlivost v MS až trojnásobně. Ligandová výměna na Hi-Plex fázích umožňuje selektivní separaci cukrů, sugar alcohols a organických kyselin prostřednictvím kombinace iontového a velikostního mechanismu.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená řešení rozšiřují možnosti analýzy polárních sloučenin v QA/QC, farmaceutickém a potravinářském průmyslu. HILIC a IP techniky umožňují dosáhnout vysoké retence, reprodukovatelnosti i citlivosti, zatímco polar-modified a ligandové fáze zajišťují robustní provoz při nízkém obsahu organiky nebo v 100 % vodném elučním systému.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj hybridních stacionárních fází kombinujících polaritu, stabilitu při extrémním pH a vysokou mechanickou odolnost. Rozšíří se využití UHPLC s mikrosekundovými gradienty pro rychlejší analýzy, integrace HILIC s vysokým rozlišením MS pro metabolomiku a vývoj automatizovaných metodických knihoven pro efektivní vývoj nových aplikací.

Závěr

Rozsáhlé uvedené přístupy poskytují analytikům nástroje k překonání omezení klasické reverzní fáze u polárních sloučenin. Klíčová je volba techniky podle chemických vlastností analytu, požadavků na citlivost a robustnost metody.

Reference

1. Przybyciel T., Majors R. J. Pore dewetting and phase collapse in reversed-phase LC. LCGC 20(6), 516–523 (2002).