Conquer Method Variability - Evaluate Variables During Method Development

Význam tématu

Variabilita chromatografických metod významně ovlivňuje spolehlivost analýz v rutinních i výzkumných laboratořích. Nedostatečná robustnost a ruggednost vede k opakovaným úpravám metody, ztrátám času i zdrojů a ohrožení kvality výsledků. Systematické vyhodnocení vlivu provozních parametrů během vývoje metody usnadňuje její přenos mezi pracovišti a zajišťuje dlouhodobou stabilitu výkonu.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje přístup k identifikaci a eliminaci klíčových zdrojů variability v kapalinové chromatografii (HPLC). Autorka rozebírá rozdíl mezi robustností (odolností vůči malým, záměrně provedeným změnám parametrů) a ruggedností (reprodukovatelností výsledků napříč laboratořemi a podmínkami), navrhuje experimentální strategie pro testování a optimalizaci metody a uvádí příklady z praxe včetně změn složení mobilní fáze, parametrů gradientu, teploty či injekčního objemu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda je vyhodnocena na standardních farmaceutických vzorcích (alkylfenony, β-laktamy, kardioaktivní sloučeniny). Klíčové proměnné testované při robustnosti:

• pH a koncentrace pufru (±0,1–0,2 pH, ±5–10 mM)
• podíl organického modifikátoru (±1–2 % obj.)
• teplota kolony (±5 °C)
• gradientní čas a tvar gradientu
• objem injekce a síla vzorkového rozpouštědla
• dwell volume systému

Instrumentace zahrnovala:

• Agilent 1290 Infinity a Infinity II (kvaternární a čtyřkanálové pumpy)
• Kolony ZORBAX Eclipse XDB-C8 (4,6×150 mm, 5 µm) a Poroshell 120 EC-C18 (4,6×50 mm, 2,7 µm)
• UV detektory 254 nm/275 nm
• Software pro počítačovou simulaci gradientu a modelování retence

Hlavní výsledky a diskuse

• Lot-to-lot reprodukovatelnost kolony: Δkʼ i selektivity <5 % při testu minimálně tří šarží
• Vliv podílu organického modifikátoru na rozlišení: změna ±2 % může ovlivnit Rs až o 30 %
• Teplota kolony: posun o 5 °C významně mění selektivitu a zkracuje analyzační čas
• Gradientní systémy: rozdíl v dwell volume mezi přístroji vede k rozdílům v retencích při přenosu metody
• Injekční objem a síla rozpouštědla: objem ≥5 µL může zhoršovat tvary piků a šíři, doporučeno ověřit opakovatelnost mezi 20–200 % navrženého objemu

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená reprodukovatelnost výsledků napříč pracovišti a provozy
• Redukce potřeby převalidace a opakovaných úprav
• Zvýšení spolehlivosti QA/QC procesů ve farmaceutickém i potravinářském průmyslu
• Optimalizace provozních nákladů díky předvídatelnému chování chromatografického systému

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace strojového učení a pokročilých simulačních nástrojů pro predikci variability parametrů
• Automatizované systémy pro kontinuální monitorování robustness během provozu
• Standardizované balíčky laboratorních testů (metoda-validation kits) pro rychlou kvalifikaci nových šarží kolony
• Rozšíření validace robustnosti na LC-MS a další detekční techniky

Závěr

Systematické testování robustness a ruggednosti během vývoje chromatografické metody je klíčové pro dosažení dlouhodobé stability, přenositelnosti a kvality analýz. Identifikace citlivých parametrů a zavedení jejich kontrolovaných rozsahů umožňuje minimalizovat riziko neočekávaných selhání a usnadňuje integraci metody v různých laboratořích.

Reference

1. USP: United States Pharmacopeia – definice ruggedness.
2. ICH Q2(R1): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, 2005.
3. Begley C.G., Buchan A.M., Dirnagl U.: Robust research: Institutions must do their part for reproducibility. Nature 525, 25–27 (2015).
4. Baker M., Penny D.: Is there a reproducibility crisis? Nature 533, 452–454 (2016).
5. Dolan J.W., Lommen D.C., Snyder L.R.: J. Chromatogr. 535 (1990) 55–75.
6. Long W.: Best LC Practices for Efficient LC Operations, Agilent Technologies Webinar, 2017.