Getting Off to a Good Start - The makings of a reliable method

Význam tématu

Reprodukovatelnost chromatografických metod je klíčová pro validitu analytických výsledků v akademickém i průmyslovém prostředí. Nízká schopnost opakovat publikované experimenty (pouze 40 % studií je reprodukovatelných) zdůrazňuje nutnost systematického vývoje a validace metod.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje postupy pro navržení spolehlivé RPLC metody s důrazem na robustnost, systémovou vhodnost a minimalizaci vlivu externích proměnných. Zabývá se také identifikací hlavních faktorů ovlivňujících rozlišení (Rs) a navrhuje, jak definovat a testovat kritická parametry během vývoje metody.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika kombinuje klasické přístupy návrhu metody s praktickými testy robustness a ruggedness:

• Optimalizace rozlišení Rs ≥ 2, injekční opakovatelnosti (RSD 0,1–0,25 %) a poměru signál/šum > 10
• Nastavení pohyblivé fáze: volba organické složky (ACN vs. MeOH), pH (2,7–4,8), koncentrace pufru (10–25 mM) a gradientní profil
• Volba kolony: částicová velikost (1,9–4 µm), porozita (totálně vs. superficially porous) a typ bonded fáze (C18, C8, PFP, HILIC, chiralní)
• Testování vlivu injekčního objemu (20–200 % nominálního) a síly vzorkového rozpouštědla
• Hodnocení vlivu systému: objem zpoždění (dwell volume) a extracolumn volume na rozlišení a tvar píků

Hlavní výsledky a diskuse

Praktické testy prokázaly, že:

• Změna pH o ±0,1–0,2 jednotky může významně ovlivnit rozlišení ionizovatelných látek
• Volba organického rozpouštědla (MeOH vs. ACN) se promítá do tlaku, šířky píků a UV transparence
• Testování tří různých výrobních šarží kolony odhalilo rozdíly v retenčních časech Rs ±0,06, které je nutné ošetřit specifikací lotu nebo úpravou gradientu
• Optimalizace objemu zpoždění a extracolumn volumu snížila šíření píků, zejména na úzkých kapilárách

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup umožní analytikům:

• Vytvořit metodiku s garantovanou opakovatelností napříč laboratořemi a instrumenty
• Rychle identifikovat citlivé body metody a zavést rozsahy provozních podmínek pro robustní provoz
• Minimalizovat počet opakovaných analýz při validaci a rutinním měření

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace vývoje metod a využití simulačních nástrojů (DryLab, chemometrie) umožní další zkrácení vývojového času. Rozvoj vysoce-paralelních a microfluidních LC systémů se zaměřením na snížení extracolumn volume a lepší kontrolu gradientu přispěje k dalšímu zvýšení robustnosti a rychlosti analýz.

Závěr

Systematický přístup k vývoji LC metody zahrnující optimalizaci rozlišení, pH, složení pohyblivé fáze, výběr vhodné kolony a kontrolu systémových parametrů (dwell volume, extracolumn volume) vede k vysoké spolehlivosti a reprodukovatelnosti. Jasně definované limity klíčových parametrů v metodické dokumentaci minimalizují potřebu opakovaných úprav a zaručují konzistentní analytickou kvalitu.

Reference

1. Baker M, Penny D. Is there a reproducibility crisis? A Nature survey lifts the lid on how researchers view the ‘crisis’ rocking science and what they think will help. Nature 533, 452–454 (2016).
2. Dolan JW, Lommen DC, Snyder LR. DryLab simulations of substituted benzoic acid sample. J. Chromatogr. 535 (1990) 55, 75.