MassHunter Qualitative Analysis Webinar Series - Qualitative Analysis Workflows

Qualitative Analysis Workflows

Howard Sanford
Stephen Harnos
With Tom Barrett & Matt Leyden & Kevin Costalunga

Qualitative  Analysis  Workflows

1

MassHunter Qualitative Analysis Webinar Series

Navigator
• User centric
• Interactive Browsing

–

Walk the Chromatogram

–

Spectrum Preview

• Spectrum ID

–

Library/Database Search

–

Molecular Formula Generator

• No concept of compounds
• No Feature Finding – ‘Find by…’
• What does the chromatography look 

like? System suitability, S/N, plates…

• What does the spectrum look of each 

peak look like?

• Can the spectrum be identified by 

searching a library?

Qualitative  Analysis  Workflows

2

Navigator and Workflows

MassHunter Qualitative Analysis Software B.08.00 SP1

Workflows
• Compound centric

• Automated Routine Workflows

Sample Purity 

Compound Discovery

Compound Identification

• Feature Finding – ‘Find by…’

• No Spectrum Preview

• No ‘User Spectra’

• All Spectra are compound based.
• What compounds can be found and 

identified?

Navigator                                                               Workflows

Qualitative  Analysis  Workflows

3

MassHunter Qualitative Analysis Software B.08.00 SP1
Navigator and Workflows

File opens in Workflows.
The sample chromatogram(s) extracted.
Spectra not extracted.
Method is NOT passed to other context.

File opens in Navigator.
The sample chromatogram(s) are extracted.
No compound results.
Method is NOT passed to other context.

Qualitative Analysis Workflows

Workflow Definitions
• Target/Suspect Screening
• Compound Discovery
• Sample Purity
• Custom
Compound Mining Algorithms
• Find by Integration
• Find by Chromatogram Deconvolution
• Molecular Feature Extraction
• Find by Formula

Compound Identification
• Library and Databases

Generating Reports

Basic Qualitative Analysis features were covered in the previous webinar available at 

www.agilent.com/en-us/training-events/eseminars/236e

Qualitative  Analysis  Workflows

4

Topics

MassHunter Qualitative Analysis Software B.08.00 SP1

Qualitative  Analysis  Workflows

5

Workflows Default Layout

MassHunter Qualitative Analysis Software B.08.00 SP1

Method Editor is a tab.

Sample Table

Compound List

Compound 

Identification  

Results

Structure 

Viewer

Sample 

Chromatogram 

Results

Compound 

Chromatogram 

and Spectrum 

Results

Open Data File Dialog Box
• Options

– Load Worklist Method
– Load Results Method
– Use Current Method

• Sample Information

• Load result data
• Run method workflow

Qualitative  Analysis  Workflows

6

Open Data File

Workflows

Qualitative  Analysis  Workflows

7

Adaptive User Interface– simplifies Method Editor

Method Editor

MS Levels MS or MS/MS

Qualitative  Analysis  Workflows

8

User Interface Configuration

• Check Show Advanced Settings 

from the Configuration menu to 
access the User Interface 
Configuration.

• Also shows advanced Method 

Editor features.

Separation types 
(Check GC or LC)

Unit Mass (SQ, TQ)
Accurate Mass (TOF, QTOF)

Open Method
• Load the method relevant to the data set.
• Method contains recommended/default 

parameters.

• Method Editor values can be modified.
• Saves time developing specific values.
• Good starting point.

• Default-GCMS-SQ.M → GCMS and GC QQQ 
• Default-GCMS.M  →GC QTOF
• Default-LCMS.M → LCMS

Qualitative  Analysis  Workflows

9

Open Method

Qualitative Analysis Methods

• Intended for routine and automated 

analysis.

– Select a workflow.
– Select the mining algorithm.
– Develop method parameters.

• Limited tools for manual spectral 

extraction.

– No spectral preview.
– Manual extraction always creates a 

compound.

• Double-click on sample in Sample Table 

to process data files with loaded 
method.

• Compound report only (no analysis 

reports).

Qualitative  Analysis  Workflows

10

Definition

Workflows

A workflow is an automated sequence of steps 
to complete a task and generate results.

• Workflow is the table of contents.

• All the steps are defined via the Method Editor.

• Default workflows depend upon data set.

• Workflows

– Target/Suspect Screening
– Sample Purity
– Compound Discovery
– Custom

• The workflow parameters can be saved as part 

of the Qualitative Analysis Workflows method.

Qualitative  Analysis  Workflows

11

Definition

Workflows

Can save 
processing time.

The Method Editor groups method sections to match workflows.

• Method Automation via workflows.
• Target/Suspect Screening
• Compound Discovery
• Sample Purity
• Custom
• Compound Identification
• Spectra
• Chromatograms

Qualitative  Analysis  Workflows

12

Method Groupings

Workflows

Compound Mining defines the algorithm to be run to find compounds.

• All the steps are defined via the Method Editor.
• Mining Algorithms depend upon data set selected.
• Mining Algorithms depend upon workflow selected.

Qualitative  Analysis  Workflows

13

Definition

Compound Mining

All features may not be visible 
with the Adaptive User 
Interface.

Auto-Select Compound Mining defines the algorithm to be run to find compounds.

• Based on data set loaded.
• Not always present, for example MRM data.
• Available with only Target/Suspect Screening and Compound Discovery.
• Good starting point.

Qualitative  Analysis  Workflows

14

Auto-Select Compound Mining

Compound Mining

“I know what I want, is it there?
• Useful with accurate mass data (TOF, 

QTOF).

• Requires a library or a database

– List of compound formulas (formulae)
– In the form of cdb, csv, cef files
– Can enter the neutral mass

• Mining Algorithms (data dependent)

– Find by Formula
– Find by Fragment (accurate mass data)

• Are the fragments logical losses?

– Find by MRM

•

Used with MRM data (QQQ)

Require RT match
Only report qualified compounds

Qualitative  Analysis  Workflows

15

Target/Suspect Screening

Workflows

“I know what I want, how pure is it?”
• Uses high resolution data.
• Requires a library or a database

– List of compound formulas (formulae)
– In the form of cdb, csv, cef files

• Mining Algorithms (data dependent)

– Find by Formula

•

Adds sample purity calculations

•

Adds the area percent calculations and 
report.

Require RT match

Only report qualified compounds

Qualitative  Analysis  Workflows

16

Sample Purity

Workflows

“I don’t know what I have, find the 

compounds and identify them”
• Library or database is optional.

– Usually one database or library is specified.
– List of compound formulas (formulae)
– In the form of cdb, csv, cef files

• Compound Mining

– Auto Select Compound Mining
– Find by Molecular Feature
– Find by Auto MS/MS
– Find by Targeted MS/MS
– Find by Integration
– Find by Chromatogram Deconvolution

Qualitative  Analysis  Workflows

17

Compound Discovery

Workflows

“I know what I need to do, generate the 

compounds!”

• Selecting Custom provides Available Actions.
• Define and refine the actions in Method 

Editor.

• Available for all datasets.

Qualitative  Analysis  Workflows

18

Custom

Workflows

Steps must be logical

• Method Editor reveals 3 algorithms

– Find by Formula
– Find by Fragments
– Find by MRM

• Selecting the ‘Find by’ in the Method Editor 

opens additional parameters.

Qualitative  Analysis  Workflows

19

Target/Suspect Screening Method Editor

Compound Mining

• Only 2 Method Editor choices

• Sample Purity parameters

• Find by Formula

– Useful for LC/TOF or QTOF data.
– Requires a formula database.

Qualitative  Analysis  Workflows

20

Sample Purity Method Editor

Compound Mining

• Multiple Compound Mining algorithms 

available.

• Find by Auto MS/MS and Find by Targeted 

MS/MS specific to QTOF data.

Qualitative  Analysis  Workflows

21

Compound Discovery Method Editor (1)

Compound Mining

• Find by Chromatogram Deconvolution

– Similar to Quantitative Analysis and 

Unknowns Analysis.

Qualitative  Analysis  Workflows

22

Compound Discovery Method Editor (2)

Compound Mining

• Component of the Method Editor

–

Establishes database or library to use.

Qualitative  Analysis  Workflows

23

Definition

Compound Identification

• Load the data file Evaldemo2.D

– Simple data file.
– GCMS SQ data.

• Load the method Default-GCMS-SQ.M.
• Set the Workflow to Compound Discovery.
• Select Find by Integration for the Compound Mining.
• Add the NIST17.L. 
• Review the Find by Integration parameters.

• Run Method Workflow or run icon.

Qualitative  Analysis  Workflows

24

Example

Find by Integration

Qualitative  Analysis  Workflows

25

Results

Find by Integration

Let’s take a moment for questions on Workflows and 
Compound Mining Algorithms

Up Next:

Data Review

MassHunter  Webinar Series

26

• Sample Table shows information about the 

sample.

– Workflow column shows most recent workflow 

applied to data file. 

• Results

– Four compounds identified (4 found in library).
– Saved Results Method.

• Must be saved and shows Qualitative Analysis 

parameters.

• Workflow

– Workflow used and library searched.

Qualitative  Analysis  Workflows

27

Data Review
Sample Table

• Acquisition 
Information about acquisition parameters.
• Toolbar

Add/Remove Columns
Run method workflow

Can run on multiple samples

Reprocess sample

Can reprocess single samples or 
reprocess with a different workflow.

Sample Information

• Compound List shows 4 compounds
• Four compounds identified
• Context menu yields numerous options for formatting

– Add/Remove Columns
– Auto Size all Columns
– Sorting
– Copying, printing and exporting

• Toolbar

– Hide any currently empty columns
– Auto Size All Columns
– Select previous and next compounds

Qualitative  Analysis  Workflows

28

Compound List

Data Review

• Additional options are available in the context menu.

– Identify Compound(s)

• Initiates Identification workflow for selected compounds.

– Search Using NIST MS Program
– Add/Edit Manual Identification

• Overwrites current Name column.

– Send Spectra to PCDL database.
– Initiate Quantitation

• Useful with MRM data
• Launches Quantitative analysis and transfers transitions 

and collision energies to the quantitation database.

Qualitative  Analysis  Workflows

29

Compound List

Data Review

Super Headers can be moved as group.

Qualitative  Analysis  Workflows

30

Super Header vs. Header

Compound List

Sub Headers can be moved with the super header.

• Compound Identification Results more 

detailed information about compounds.

– Detailed information about identified 

compound.

• May be tabbed window in default layout.
• Shows 5 library hits.
• Sub level shows additional information 

about identified compound.

• Context menu yields numerous options for 

formatting.

– Add/Remove Columns
– Auto Size all Columns
– Sorting
– Copying, printing and exporting

• Toolbar

– Hide any currently empty columns
– Auto Size All Columns

Qualitative  Analysis  Workflows

31

Compound Identification Results

Data Review

Qualitative  Analysis  Workflows

32

Sample Chromatogram Results

Data Review

• Sample Chromatogram Results.

– Can be overlaid or list modes

• Toolbar

– Autoscale X-axis and Y-axis
– Autoscale X-axis
– Autoscale Y-axis
– Unzoom (multiple levels)
– Autoscale Y-axis during zoom
– List mode or overlaid mode
– Maximum number of panes
– Compound overlay mode
– Extract Chromatograms (allows TIC, 

BPC, EIC, etc. to be extracted.

– Scale Chromatogram Off
– Scale to Largest in Each 

Chromatogram

– Integration Peak List
– Chromatogram Display Options
– Print

Qualitative  Analysis  Workflows

33

Compound Chromatogram Results

Data Review

• Compound Chromatogram Results

– Displays the TCC
– Can be overlaid or list modes

• Toolbar

– Autoscale X-axis and Y-axis
– Autoscale X-axis
– Autoscale Y-axis
– Unzoom (multiple times)
– Autoscale Y-axis during zoom
– List mode or overlaid mode
– Maximum number of panes
– Show Legend in Overlaid Mode
– Range Select tool
– Annotation Mouse Tool
– Scale to Largest in Each Chromatogram
– Integration Peak List
– Coelution Plot
– Chromatogram Display Options
– Print

Qualitative  Analysis  Workflows

34

Compound MS Spectrum Results

Data Review

• Compound MS Spectrum Results.

– Can be overlaid or list modes

• Toolbar

– Autoscale X-axis and Y-axis
– Autoscale X-axis
– Autoscale Y-axis
– Unzoom (multiple times)
– Autoscale Y-axis during zoom
– List mode or overlaid mode
– Maximum number of panes
– Show Predicted Isotope Distribution
– Range Select tool
– Annotation Mouse Tool
– Delta Mass Caliper tool
– Spectrum Peak List
– Spectrum Display Options
– Print

Qualitative  Analysis  Workflows

35

Spectral Difference Results

Data Review

• Spectral Difference Results
• View > Difference 

Results activates this 
window

• Toolbar

– Autoscale X-axis and Y-

axis

– Autoscale X-axis
– Linked Y-axis mode

Extracted Spectrum

Mirror Plot

Library Spectrum

Qualitative  Analysis  Workflows

36

Structure Viewer

Data Review

• Composed of two tabs
• Structure tab
• MOL Text 

– Must be available in library
– Easily copied to clipboard

Let’s take a moment for questions on Data Review

Up Next:

Find by Chromatogram Deconvolution

MassHunter  Webinar Series

37

• One of the ‘Find by…..’ algorithms.
• Useful to determine what is in a sample.
• Optional identification through the  Compound 

Identification > Identification Workflow in the Method 
Editor.

Qualitative  Analysis  Workflows

38

Case Study

Find by Chromatogram Deconvolution

TIC

Compound 1

Compound 2

Compound 3

One gaussian peak but  actually 
composed of three compounds.

An average spectrum is created over the entire or selected RT range.

An EIC is extracted for each mass in the average spectrum. 

Each EIC is integrated using the Agile integrator and “EIC peaks” are created. 

The “EIC peaks” are grouped together based on common RT and each set of “EIC peaks” become 

“Compounds”. 

The “EIC peak” shape is used to create a Compound peak shape.

Filters can remove small ions and “compounds” with only a few small ions. 

The relative intensity (area) of the “EIC peaks” and the mass of the EIC are used to create a clean 

spectrum of the Compound.  

Qualitative  Analysis  Workflows

39

Case Study

Find by Chromatogram Deconvolution

The algorithm creates Extracted Ion Chromatograms (EICs) across a small 
time range around the apex spectrum RT.

Qualitative  Analysis  Workflows

40

Case Study

Find by Chromatogram Deconvolution

50

170

280

310

75

185

160

50

170

280

75

185

310

TIC

160

Uncleaned apex mass spectrum

Qualitative  Analysis  Workflows

41

Case Study

Find by Chromatogram Deconvolution

280

185

Cleaned mass spectra

170

75

50

310

160

75

170

185

280

50

160

310

•RT window size factor

– Key parameter that controls grouping

– Smaller number → more compounds

– Possible ‘fake’ compounds

• Excluded m/z

• Spectrum peak threshold

• SNR threshold

• Extraction window

– Mass defect → -0.3 to +0.7  Low resolution

– High resolution in ppm.

• Component shape

– Upper 75% of peak is considered.

Qualitative  Analysis  Workflows

42

Deconvolution Parameters

Find by Chromatogram Deconvolution

•Mass filters are applied after the EICs are organized into 
compounds.

– Remove small ions from the compounds based on absolute 

height or relative height of base peak or both.

• Compounds Filters are applied to the compounds based 

on absolute area or relative area of the largest compound 
or both.

• Results

– Clear previous results is unchecked allows multiple algorithms 

to be applied.

Qualitative  Analysis  Workflows

43

Deconvolution Parameters

Find by Chromatogram Deconvolution

Let’s take a moment for questions on Find by Chromatogram 
Deconvolution

Up Next:

Molecular Feature Extraction

MassHunter  Webinar Series

44

MFE (Molecular Feature Extraction)
• Untargeted analysis for a unique molecular entity based on three dimensional array of retention time, 

mass and abundance in GC or LC MS data. Operates on raw scan data.

– Evaluates the data as a three dimensional array based on retention time, mass and abundance.
– Removes persistent or slowly changing background.
– Looks for masses with a common elution profile at approximately the same time.
– Masses are grouped into compounds.
– Co-eluting interferences are resolved.
– Isotopic cluster are determined and grouped (accurate mass).
– Charge state assignments and molecular adducts are recognized (multi-charged species and ESI).
– 2D/3D visualization of data.
– Chemical characterization and identification.

Qualitative  Analysis  Workflows

45

Case Study

Find by Molecular Feature 

MFE (Molecular Feature Extraction)

Qualitative  Analysis  Workflows

46

Case Study

Find by Molecular Feature 

398.6

398.8

399.0

399.2

399.4

399.6

Drift Time (ms) vs. m/z

38

39

40

41

398

399

400

401

402

403

404

Drift Time (ms) vs. m/z

36

37

38

39

40

41

42

Identify the highest point in the three 
dimensional array.

MFE (Molecular Feature Extraction)

Qualitative  Analysis  Workflows

47

Case Study

Find by Molecular Feature 

398.6

398.8

399.0

399.2

399.4

399.6

Drift Time (ms) vs. m/z

38

39

40

41

398

399

400

401

402

403

404

Drift Time (ms) vs. m/z

36

37

38

39

40

41

42

Identify the highest point in the three dimensional 
array.

Expand the array to include neighboring data 
points.

MFE (Molecular Feature Extraction)

Qualitative  Analysis  Workflows

48

Case Study

Find by Molecular Feature 

398.6

398.8

399.0

399.2

399.4

399.6

Drift Time (ms) vs. m/z

38

39

40

41

398

399

400

401

402

403

404

Drift Time (ms) vs. m/z

36

37

38

39

40

41

42

Identify the highest point in the three 
dimensional array.
Expand the array to include neighboring data 
points.
Once the bounds of the array have been 
established, save the 3D peak array.
Resolve co-eluting interferences.
Chemical characterization and subsequent 
identification.
Reiteratively repeat the process.

MFE (Molecular Feature Extraction)

Qualitative  Analysis  Workflows

49

Case Study

Find by Molecular Feature 

398.6

398.8

399.0

399.2

399.4

399.6

Drift Time (ms) vs. m/z

38

39

40

41

398

399

400

401

402

403

404

Drift Time (ms) vs. m/z

36

37

38

39

40

41

42

Identify the next highest point in the three 
dimensional array.
After completed, reiteratively process the 
next highest point in the array.

MFE (Molecular Feature Extraction)
• The algorithm effectively processes the three dimensional array based on retention time, mass and 

abundance.

• The algorithm does not evaluate the information based on spectra or chromatograms.
• The process is reiteratively applied to the entire data array until no peak remains above background.
• Noise is effectively removed.
• Highly computationally intensive but very effective in identifying compounds.

Qualitative  Analysis  Workflows

50

Case Study

Find by Molecular Feature