Achieving robust, accurate TMT quantitation efficiency with Tribrid technology

Význam tématu

Multiplexní kvantitativní proteomika s izobarickými TMT štítky, obzvláště v kombinaci se synchronní selekcí prekurzorů (SPS) ve fázi MS3, přináší zvýšenou přesnost, citlivost a propustnost. Tento přístup je klíčový pro studie biologických vzorků, kde je třeba simultánně sledovat relativní změny proteinových hladin v různých experimentech.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem textu je demonstrovat výhody revoluční Tribrid technologie (Orbitrap Fusion Lumos) s metodou SPS MS3 v rámci vysokopropustné kvantitativní proteomiky. Shrnutí obsahuje:

• principy izobarického značení TMT10plex a jeho multiplexního potenciálu,
• omezení konvenčních MS2/MS3 přístupů v kvantitativní přesnosti a rozsahu pokrytí,
• popis SPS MS3 metody jako řešení pro potlačení interference a zvýšení intenzity reporter iontů.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje enzymatickou digesci proteinů, značení TMT10plex izobarickými značkami, podrobnou frakcionaci a chromatografii peptidů. Analýza probíhá na Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometeru se SPS MS3 protokolem: MS1 měření v Orbitrapu, izolace prekurzorů v segmentovaném kvadrupólu, CID fragmentace v iontové pasti, synchronní izolace až 20 MS2 fragmentů (SPS) a následná HCD fragmentace s detekcí v Orbitrapu.

Hlavní výsledky a diskuse

• SPS MS3 zlepšilo intenzitu reporter iontů až desetinásobně oproti standardnímu jednonotch MS3, obnovilo kvantitativní přesnost a rozšířilo dynamický rozsah.
• Optimalizované zdroje iontů (vysoce kapacitní transferní trubice a iontový trychtýř) a segmentovaný kvadrupól přinesly 2–5× vyšší přenos iontů, umožňují užší izolační okna (0,4 Da) bez ztráty identifikací.
• V reálných aplikacích bylo reprodukovatelně kvantifikováno přes 170 000 změn proteinové abundance v panelu nádorových buněčných linií.
• Srovnání s platformami Q Exactive a Orbitrap Elite potvrdilo, že Tribrid systémy poskytují nejlepší kombinaci throughputu, citlivosti a flexibility pro vysoce multiplexní analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Současná analýza až 10 vzorků šetří čas a vzorek a umožňuje komplexní statistické vyhodnocení.
• Minimalizace chybějících hodnot a variability běhů díky sloučení identifikace a kvantifikace v jednom experimentu.
• Možnost detailních experimentů časových řad, dávkových studií, subcelulárních frakcí a různých typů biologického materiálu.
• Uplatnění v biomedicínském výzkumu, vývoji léčiv, objevování biomarkerů a QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření multiplexu nad 10 kanálů s novými izobarickými značkami.
• Integrace s automatizovanými workflow a novými předzpracovacími krokem pro klinické aplikace.
• Vývoj rychlejších MS3 scanů a vyššího rozlišení pro citlivější detekci nízkoodběrových proteinů.
• Adaptace Tribrid systémů pro prostorovou proteomiku a single-cell analýzy.

Závěr

Kombinace TMT10plex značení se SPS MS3 na Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS znamená průlom v kvantitativní proteomice, spojující vysokou citlivost, přesnost a throughput. Tato metoda otevírá nové možnosti výzkumu v biomedicíně i průmyslové analytice.

Reference

1. Ow SY a kol., J. Proteome Res. 2009, 8(11), 5347–5355.
2. Ting L a kol., Nat. Methods 2011, 8, 937–940.
3. McAlister G a kol., Anal. Chem. 2014, 86, 7150–7158.
4. Saba J a Viner R., C&EN whitepaper, ACS.
5. Minajigi A a kol., Science 2015, 349.
6. Klein T a kol., Nat. Commun. 2015, 6.
7. Christoforou A a kol., Nat. Commun. 2016, 7.
8. Mehrabian M a kol., PLOS ONE 2014, 9(12), e114594.
9. Nicolay B a kol., Genes Dev. 2015, 29, 1875–1889.