Capillary-flow LC-UV sample quality control for low-flow LC-MS based proteomics

Význam tématu

Proteomické analýzy nízkoprůtokovou LC-MS vyžadují spolehlivou kontrolu kvality vzorků před analýzou, aby se předešlo poškození kolony a zbytečným prostojům způsobeným nečistotami či nekompletní digescí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní a vysoce propustnou metodu pro předběžné hodnocení kvality proteomických vzorků pomocí kapilární LC-UV před nízkoprůtokovou LC-MS analýzou. Využití monolitických PepSwift kolon přináší kombinaci citlivosti a odolnosti.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: Infliximab (monoklonální protilátka) digesovaný trypsinem pomocí SMART Digest kitu v různých časech (5, 10, 20, 45 min).
• Kapilární předkoncentrační LC-UV: UltiMate 3000 RSLCnano se soupravou monolitických PepSwift kolon (trap a analytická etapa), UV detekce na 214 nm.
• Mobilní fáze: A – voda s 0,05 % TFA, B – voda/acetonitril (50:50) s 0,04 % TFA, načítací pufr – voda s 0,05 % HFBA.
• Průtoky: načítání 10 μL/min, eluce 3 μL/min, teplota kolony 60 °C, autosampler 5 °C.
• Volitelně LC-UV-MS: Q Exactive HF s EASY-Spray ion source pro charakterizaci peptidů.

Hlavní výsledky a diskuse

Doplňková LC-UV analýza ukázala výrazné rozdíly mezi částečně (5 min) a zcela (45 min) digesovanými vzorky, přičemž kratší digesce obsahovala velké fragmenty s opomenutými štěpnými místy a delší digesce detekovala menší peptidy. Měření zpětného tlaku prokázalo vysokou odolnost monolitické kolony vůči nedokončeným vzorkům. Metoda také efektivně identifikovala kontaminaci detergenty (např. Triton), jež by jinak poškodily nanoLC-MS systém.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a vysoce propustné předvyhodnocení vzorků bez nutnosti přímého použití MS.
• Odolnost vůči nespecifickým nečistotám a nedokončené digesci.
• Snížení neplánovaných prostojů a minimalizace nákladů na údržbu nanoLC-MS.
• Vhodné pro otevřený přístup v rdících centrech a výrobních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s automatizovanými pracovními postupy a robotizovanými systémy.
• Rozšíření na další typy biologických vzorků a různé typy proteinů.
• Použití umělé inteligence pro prediktivní kontrolu kvality a optimalizaci digesce.
• Kombinace s dalšími detekčními metodami, jako je IMS nebo spektroskopie.

Závěr

Navržená kapilární LC-UV metoda s monolitickými PepSwift kolonami poskytuje rychlou, citlivou a odolnou kontrolu kvality proteomických vzorků před nízkoprůtokovou LC-MS analýzou. Umožňuje detekci nedokončené digesce i kontaminace detergenty, čímž přispívá ke zvýšení spolehlivosti a efektivity proteomických workflow.

Použitá instrumentace

• UltiMate 3000 RSLCnano kapilární systém
• PepSwift monolitické kolonky (analytická 200 μm × 5 cm a trap 200 μm × 5 mm)
• UV detektor VWD-3400RS, 214 nm
• Q Exactive HF MS s EASY-Spray ion source (volitelné)

Reference

1. Meding S., Boychenko A., Capillary Flow LC-MS Unites Sensitivity and Throughput, Chromatography Today, 2016.
2. UltiMate 3000 RSLCnano System – Versatility and Performance, BR-71898, 2016.
3. Zhou J.-Y. et al., Simple SDS-assisted sample preparation for LC-MS-based proteomics, Anal. Chem., 2012.
4. Boychenko A. et al., Capillary-flow LC-MS: combining high sensitivity, robustness and throughput, TN-72277, 2017.