A pre-concentration and online solid phase extraction setup for the LC-MS analysis of therapeutic protein mixtures

Význam tématu

Solid-phase extraction in-line s UHPLC a orbitrapovou hmotnostní spektrometrií je klíčová pro rychlé a automatizované čištění komplexních proteinových vzorků v biopharmaceutickém a výzkumném prostředí. Minimalizuje riziko kontaminace a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie/článku

Cílem bylo demonstrovat plně automatizované nastavení online SPE pomocí Thermo Scientific Vanquish UHPLC a Q Exactive HF mass spectrometru. Metoda využívá dvoustupňové řešení: zachycení proteinů na trap kolonce MSPac DS-10 a následnou separaci na analytické MAbPac RP kolonce s gradientem vody a acetonitrilu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek tvořila směs pěti modelových proteinů (ribonukleáza A, cytochrom C, rituximab, myoglobin, alfa-laktalbumin) ve formikační kyselině. Postup zahrnoval:

• Načtení vzorku (60 µg/mL) na trap kolonce při 0,3 mL/min isokraticky 0,1 % TFA (2 min).
• Přepnutí 2p6p ventilu do eluce, back-flow eluce proteinů gradientem 0,1 % FA voda/acetonitril na analytické RP kolonce při 0,1 mL/min.
• Prodloužené zahřívání trap i analytické kolony na 70 °C kvůli optimalizaci retence a tvaru píků.

Instrumentace:

• Vanquish Flex UHPLC: quaternární low-pressure a binární high-pressure gradient pumpa, 2p6p kolonkový ventil, MSPac DS-10 trap, MAbPac RP analytická kolona, UV detektor 45 nL.
• Orbitrapový Q Exactive HF s HESI-II zdrojem, zdrojové plyny 25 psi, teploty 150–280 °C, full MS scan (m/z 500–5000), rozlišení 120k/15k, AGC 3e6.

Hlavní výsledky a diskuse

Testy ukázaly zásadní vliv teploty na efektivitu zachycení mAb. Při room temperature chyběla špička rituximabu, zatímco při 70 °C byl zajištěn plný návrat a úzké píky všech pěti proteinů.
Baseline separace se zobrazila v chromatogramu TIC, selektivní eluce TFA a dalších velmi polárních složek. Izotopicky rozlišené spektra umožnila dekonvoluci a stanovení přesné hmotnosti dle BioPharma Finder s odchylkou <5 ppm pro všechny proteiny a glykoformy rituximabu.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované online SPE:

• Eliminuje manuální kroky, zrychluje přípravu vzorků a minimalizuje chyby.
• Podporuje vysoké injekční objemy pro nízko abundantní analyty.
• Umožňuje přímou injekci vzorků bez předchozí offline úpravy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na komplexnější proteomické aplikace, včetně peptidových map a vysokoobjemových screeningů.
• Integrace do automatizovaných laboratoří s LIMS řízením a umělou inteligencí pro optimalizaci workflow.
• Adaptace na další biomolekuly, včetně konjugovaných proteinů a antivirových protilátek.

Závěr

Popisovaná plně automatizovaná online SPE-UHPLC-MS metoda demonstrovala vysokou robustnost, reprodukovatelnost a přesnost stanovení intact proteinů. Nastavení je kompatibilní s GMP/GLP a přináší efektivní řešení pro biopharma QC i výzkumné laboratoře.

Reference

1. Dillon TM, Bondarenko PV, Rehder DS, Pipes GD, Kleemann GR, Ricci MS. J Chromatogr A. 2006, 1120, 112–120.
2. Thermo Scientific Technical Note 173: Influence of Column Temperature on Reversed-Phase Chromatography of an Intact Antibody. 2015.
3. Fekete S, Rudaz S, Veuthey JL, Guillarme D. J Sep Sci. 2012, 35, 3113–3123.