Reverse Triiodothyronine (rT3) Quantitation in Blood Serum for Research Purposes by LC-MS/MS using Liquid-Liquid Extraction following Protein Precipitation

Význam tématu

Reverse trijodtyronin (rT3) je neaktivní izomer hormonu trijodtyroninu (T3), jehož stanovení v séru je klíčové pro výzkum metabolických změn při hladovění, kritické nemoci a dysfunkci štítné žlázy.

Cíle a přehled studie

Metoda zaměřená na kvantifikaci rT3 v koncentracích 5–60 ng/dL v lidském séru za využití rychlé sedmiminutové LC-MS/MS analýzy s cílem dosáhnout vysoké přesnosti, reproducibility a schopnosti srovnání výsledků s referenční laboratoří.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly zpracovány kombinací precipitace proteinů acetonitrilem a následnou extrakcí ethylacetátem. Suché extrakty byly rehydratovány v 25% acetonitrilu a analyzovány LC-MS/MS:

• LC systém: Thermo Scientific Transcend LX-4 s 4 kanály
• Kolona: Thermo Scientific Accucore aQ (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) při 60 °C
• Mobilní fáze: gradient metanol/voda s 0,1% kyselinou mravenčí
• MS/MS: Thermo Scientific TSQ Quantis s HESI zdrojem, SRM přechody 651,8→605,8 a 651,8→507,9 pro rT3
• Software: Thermo Scientific TraceFinder s Aria MX pro řízení analýzy a vyhodnocení dat

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární oblast pro rT3 byla potvrzena v rozsahu 5–60 ng/dL s průměrnou iontovou poměrovou konfirmací kolem 55%. V rámci intra-batch variabilita činila CV <6 % a inter-batch CV <8 %. Korelace měření 60 donorsých sér mezi výzkumnou a referenční laboratoří vykazovala průměrnou odchylku 2 % a pouze jedno měření převýšilo 20% limit. Nosnost metody dosahovala 9 až 36 injekcí za hodinu při použití 1–4 kanálů. Matrixové efekty byly kompenzovány pomocí 13C6 vnitřního standardu, ovšem metoda není doporučena pro hemolýzu a silně lipemické vzorky.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a citlivá kvantifikace nízkých koncentrací rT3 v biologických vzorcích
• Vysoká přesnost a reprodukovatelnost vhodná pro výzkumné studie metabolických poruch
• Možnost paralelního provozu více kanálů pro zvýšení průtokovosti
• Kompenzace matrixových efektů díky izotopově značenému internímu standardu

Budoucí trendy a možnosti využití

Vznikají příležitosti pro integraci metody do víceanalyzových panelů thyroidálních hormonů, automatizaci přípravy vzorků, miniaturizaci extrakčních postupů a využití strojového učení pro optimalizaci datové analýzy a detekci interferencí.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro kvantifikaci rT3 v krevním séru splňuje požadavky na citlivost, přesnost i průtokovost a její výsledky jsou vynikajícím způsobem srovnatelné s referenčními laboratořemi. Metoda je vhodná pro rozsáhlé výzkumné projekty zabývající se metabolickými a endokrinologickými studiemi.

Reference

• Di Bussolo J., Xie X., Castillo R., Mustafa A., Othman H. Reverse Triiodothyronine (rT3) Quantitation in Blood Serum for Research Purposes by LC-MS/MS using Liquid-Liquid Extraction following Protein Precipitation. MSACL 2019 US, Poster 4c