Sequential enrichment from Metal Oxide Affinity Chromatography (SMOAC), a phosphoproteomics strategy for the separation of multiply phosphorylated from monophosphorylated peptides.

Význam tématu

Identifikace a kvantifikace vícefosforylovaných peptidů je klíčová pro pochopení buněčných signalizací, regulaci proteinů a vývoj terapeutických přístupů. Standardní obohacovací metody často selhávají při zachycení nízkoabundantních multiplosforylovaných peptidů, což omezuje hloubku fosfoproteomických analýz.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává dvě sekvenční obohacovací strategie – SMOAC (TiO2–Fe-NTA) a SIMAC (Fe-NTA–TiO2) – a hodnotí přínos následné frakcionace při analýze Nocodazole synchronizovaných HeLa buněk. Cílem je maximalizovat identifikaci multiplosforylovaných peptidů a celkovou pokrytí fosfoproteomu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro SMOAC byla nejprve provedena enrichace TiO2 kinetikou, následuje obohacení zbývající frakce na HiSelect Fe-NTA. SIMAC obrací pořadí. Po SMOAC byla kombinovaná eluovaná frakce podrobena vysokopH reverzní frakcionaci.

• Vzorek: 1 mg tryptického digestu z Nocodazole-arrestovaných HeLa buněk.
• Odbourání intervencí: TiO2 a Fe-NTA fázové obohacení pomocí Thermo Scientific Pierce sad.
• Frakcionace: vysokopH spin kolony, 9 frakcí.
• LC-MS/MS: Thermo EASY-Spray C18 kolona, Orbitrap Fusion Tribrid (full scan 120 000, HCD 30 %, AGC 4e5/1e4).
• Data processing: Proteome Discoverer 1.4, SEQUEST HT, 1 % FDR, phosphoRS lokalizace.

Hlavní výsledky a diskuse

SMOAC dosáhla 97 % selektivity pro fosforylované peptidy, identifikovala 12735 peptidů oproti 11956 u SIMAC. Z nich bylo 3908 dvojitě a 839 trojitě fosforylovaných peptidů. SIMAC přinesla jen 8 % dalších unikátních peptidů, což ukazuje limitovaný benefit obráceného pořadí.
Frakcionace po SMOAC zvýšila počet unikátních fosfopeptidů z 22165 na 32584 (nárůst ~47 %). TMT-označený vzorek potvrdil přínos SMOAC i pro kvantitativní analýzu, přidáno bylo ~5000 unikátních fosfoproteinů v 74 dráhách, včetně klíčových signálních cest AMPK.
Detailní analýza ukázala nové fosforylační pozice na kondenzinovém subunitu a na fosfatáze CDC25C (např. Ser-984, Thr-48, Ser-268), které nebyly odhaleny standardními přístupy.

Přínosy a praktické využití metody

SMOAC v kombinaci s frakcionací umožňuje:

• Hloubkovou analýzu fosfoproteomu s vysokou selektivitou pro multiplosforylované peptidy.
• Odhalení nových modifikačních míst na regulačních proteinech.
• Zvýšení pokrytí signálních drah ve funkčních studiích.
• Integraci s TMT kvantifikací pro komparativní proteomiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření SMOAC principu na další posttranslační modifikace, automatizace obohacovacích kroků a integrace s datovými platformami AI pro hloubkové biologické interpretace. Kombinace s iontovou mobilitou a novými frakcionačními přístupy může ještě zvýšit analytický výkon.

Závěr

Strategie SMOAC následovaná vysokopH frakcionací významně překonává tradiční SIMAC a izolaci na jedné matrici. Metoda přináší hlubší pokrytí fosfoproteomu, efektivní obohacení multiplosforylovaných peptidů a odhalení nových biologicky významných modifikací.

Reference

• Thingholm T.E., Jensen O.N., Robinson P.J., Larsen M.R. SIMAC, a phosphoproteomics strategy for separation of mono- from multiply phosphorylated peptides. Mol. Cell. Proteomics. 2008;7:661–671.
• Ficarro S.B. et al. Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae. Nat. Biotechnol. 2002;20:301–305.
• Abe S. et al. Cdk1-mediated phosphorylation of condensin II subunit CAP-D3 in chromosome condensation. Genes Dev. 2011;25(8):863–874.
• Dephoure N. et al. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008;105:10762–10767.
• Sharma K. et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr signaling. Cell Rep. 2014;8:1583–1595.
• Chan P.M., Ng Y.W., Manser E. Protocol to map 14-3-3 interactome: CDC25C phosphorylation and binding. Mol. Cell Proteomics. 2011;10:M110.005157.
• Esmenjaud-Mailhat C. et al. Phosphorylation of CDC25C at S263 controls localisation. FEBS Lett. 2007;581(21):3979–3985.
• Jensen S.S., Larsen M.R. Impact of experimental procedures on phosphopeptide enrichment. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007;15:3635–3645.