Turnkey, Multi-pathway Signaling Analysis Using a Synthetic Phosphopeptide Panel, Standardized Sample Preparation Kits and SureQuant Internal Standard Targeted Quantitation

Význam tématu

Analýza fosfoproteomiky je klíčová pro pochopení regulačních procesů v buňkách, identifikaci biomarkerů a vývoj terapeutik. Přesná a reprodukovatelná kvantifikace fosforylace umožňuje detailní mapování signálních drah, které se podílejí na vzniku onemocnění a odpovědi na léčbu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo navrhnout univerzální workflow pro selektivní obohacení fosfopeptidů a cílenou kvantifikaci biologicky relevantních fosforylačních míst napříč několika signálními drahami. Autoři porovnali tradiční datově závislou akvizici (DDA) a paralelní monitorování reakcí (PRM) s novou SureQuant metodou podporovanou interními standardy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro obohacení fosfopeptidů autoři aplikovali sekvenční SMOAC (High-Select TiO2 a Fe-NTA). Do tryptických štěpů HeLa lyzátu byl přidán 1 pmol syntetického heavy-izotopového panelu 138 fosfopeptidů. Po čistění na Peptide Desalting Spin Columns následovalo oddělení na Thermo Scientific™ EASY-nLC™ 1200 s EASY-Spray™ C18 kolonkou (ES804) a gradientem 2,4–34 % acetonitrilu v 60 minutách.
SureQuant, DDA a PRM akvizice probíhaly na Orbitrap Exploris 480. Analýza DDA dat se prováděla v Proteome Discoverer 2.2 se SEQUEST™ HT, cílená data v Skyline s vyhodnocením poměrů light/heavy.

Hlavní výsledky a diskuse

SureQuant workflow významně překonal DDA i PRM v počtu detekovaných cílových fosfopeptidů:

• DDA: 110 syntetických standardů, 10 endogenních peptidů
• PRM: 33 endogenních peptidů
• SureQuant: 131 endogenních peptidů

SureQuant dynamicky rozpoznává interní standardy a při jejich detekci upravuje fill-time pro MS2, čímž dosahuje až 6× delšího akumulačního času a lepší citlivosti. Díky tomu se výrazně rozšířil dynamický rozsah měření a spolehlivě se kvantifikovaly nízké koncentrace fosfopeptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Turnkey workflow kombinuje standardizovanou přípravu, sekvenční SMOAC obohacení a SureQuant cílenou akvizici, což nabízí:

• Vyšší spolehlivost a reprodukovatelnost
• Citlivou detekci nízkoabundantních fosfopeptidů
• Možnost simultánní analýzy více signálních drah
• Vhodnost pro rutinní QA/QC a akademický výzkum

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje zahrnují rozšíření počtu cílových fosfosites, zkrácení chromatografických běhů, integraci s AI řízenou akvizicí a aplikace na single-cell fosfoproteomiku. Automatizace SMOAC a škálovatelné multiplexní přístupy umožní širší využití v klinických studiích.

Závěr

Popsaný workflow založený na SMOAC a SureQuant se syntetickými interními standardy poskytuje robustní, citlivou a vysoce reprodukovatelnou metodu kvantifikace 138 fosforylačních míst napříč klíčovými signálními drahami. Metoda výrazně překonává tradiční DDA a PRM přístupy a je vhodná pro rutinní a pokročilé fosfoproteomické aplikace.

Reference

Gajadhar AS, Patel B, Jensen P, Gallien S, Huguet R, Opperman K, Rogers JC, Huhmer A, Lopez-Ferrer D. Turnkey, Multi-pathway Signaling Analysis Using a Synthetic Phosphopeptide Panel, Standardized Sample Preparation Kits and SureQuant Internal Standard Targeted Quantitation. Thermo Fisher Scientific; 2020.