Targeted nano LC-MS Quantification of Rituximab in Human Bio-Matrix with High-Resolution Accurate Mass MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčové biofarmaceutikum pro léčbu nádorových, autoimunitních a chronických onemocnění. Jejich kvantifikace v komplikovaných biologických matricích, jako jsou buněčné lyzáty, je nezbytná pro farmakokinetyčné a farmakodynamické studie a kontrolu kvality léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout cílenou nano LC-MS metodu pro kvantifikaci rituximabu v komplexním humaním bio-matrici (HeLa cell lysate) s využitím vysokorozlišovacího přesného hmotnostního spektrometru. Studie porovnala netargetované (DDA) a cílené režimy (tSIM, PRM) a ověřila linearitu, selektivitu a citlivost.

Použitá instrumentace

• Chromatografie: Thermo UltiMate 3000 RSLCnano se systémem ProFlow a EASY-Spray™ 75 µm × 50 cm Acclaim™ PepMap™ C18 (2 µm, 100 Å).
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Q Exactive™ HF Orbitrap, iontový zdroj EASY-Spray™.
• Sbírání dat: Thermo Chromeleon™ CDS 7.2, Proteome Discoverer™ 2.0, Pinpoint™ 1.4.0, Skyline 3.1, PepFinder™ 2.0.
• Příprava vzorku: SMART Digest™ kit (Thermo Scientific), redukce TCEP (5 mM, 30 min, 60 °C).

Použitá metodika

• Vzorky: HeLa buň. lyzát (100 ng/µL) s přidaným rituximabem v poměrech 1:10² až 1:10⁵.
• Digesce: trypsin, redukce disulfidů TCEP, následné zředění na 0,2–20 pg/µL.
• LC gradient: 30 min (0–35 % B), tok 300 nL/min, fáze A: voda/0,1 % FA, fáze B: ACN/0,1 % FA.
• MS režimy: DDA (TOP20, MS1 60 000, MS2 15 000), tSIM (120 000, izolační okno 2 m/z), PRM (MS2 60 000, iz. okno 2 m/z).

Hlavní výsledky a diskuse

• DDA odhalilo ~2800 proteinů, ale rituximab byl na spodním konci intenzitního rozdělení (4 řády dynamického rozsahu).
• Bylo identifikováno osm unikátních tryptických peptidů rituximabu s vysokou intenzitou a dobrou retenční opakovatelností (RSD <0,2 %).
• tSIM dosáhlo lineární kalibrace přes 4 řády od amol do fmol, LOD ~30 amol čistého proteinu.
• PRM poskytlo nejvyšší selektivitu ve vzorcích s poměrem rituximab/HeLa až 1:7,5×10⁴, zachovalo úzké chromatografické vrcholy (~3 s FWHM) a dostatečný počet skenů pro kvantifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a selektivita umožňuje přesné stanovení nízkých hladin mAb ve složitých vzorcích.
• Přesná kontrola retenčních časů (RSD <0,2 %) dovoluje plánované (scheduled) metody s úzkými okny.
• Metoda je vhodná pro farmakokinetické studie, QA/QC a validaci bioanalytických postupů v biotechnologiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Multiplexní cílené kvantifikace více protilátek v jediném běhu.
• Integrace imunoprecipitace a mikrofluidních platforem pro zlepšení procesu přípravy vzorku.
• Využití strojového učení k predikci retenčních časů a automatizované optimalizaci metod.
• Rozšíření na další třídy bioterapeutik (ADC, bispecifické protilátky).

Závěr

Robustní nano­LC separace s ProFlow a cílená HRAM kvantifikace (tSIM, PRM) umožňují vysoce selektivní a citlivé stanovení rituximabu v komplexních biologických matricích. Metoda dosahuje sub­fmol citlivosti, linearity přes 4 řády a vynikající opakovatelnosti retenčních časů, což ji činí perspektivní pro biofarmaceutický výzkum a kontrolu kvality.

Reference

1. Samonig M., Swart R. LC-UV-MS Peptide Mapping Development for Easy Transfer to LC-UV QA/QC. Application Note 1134. Thermo Fisher Scientific. 3 p.
2. UniProtKB - P01857 (IGHG1_HUMAN). http://www.uniprot.org/uniprot/P01857