From analytical to nano-flow LC-MS: high robustness and sensitivity to answer complex biological questions

Význam tématu

Downscaling kapalinové chromatografie ke kapilárnímu, nano- a sub-nano-průtoku vede k výraznému nárůstu citlivosti a selektivity LC-MS metod. Tyto přístupy umožňují analýzu omezených vzorků, hlubokou proteomiku, detekci biomarkerů v komplexních matricích i kvantifikaci na velmi nízké úrovni.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje systématické srovnání analytického (>450 µL/min), mikro- (100 µL/min), kapilárního (15–30 µL/min), nano- (300 nL/min) a sub-nano-LC-MS (<100 nL/min) z hlediska citlivosti, reprodukovatelnosti, průtoku a možnosti hluboké proteomické analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolony o různých vnitřních průměrech (2,1 mm až 25 µm) a délkách (15 – 75 cm) s částicemi 1,9 – 2,6 µm.
• Rozhraní ESI zdroje optimalizované pro nízké průtoky.
• LC systémy Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano a EASY-nLC 1200.
• Mass spektrometry Thermo Scientific Q Exactive HF, Orbitrap Fusion Lumos a Exactive HF hybrid quadrupole-Orbitrap.
• Prototypové ultra-low-flow nastavení: kolona 25 µm × 25 cm, emitery 10 µm.

Hlavní výsledky a diskuse

• Citlivost roste s klesajícím průtokem: micro-LC 2–4×, capillary-LC 4–50×, nano-LC >50×, sub-nano >100× oproti analytickému režimu.
• Nano-LC-MS dosahuje základních špičkových chromatogramů pro 1 µg vzorku HeLa lysátu s třikrát vyšší intenzitou.
• Pro delší kolony (75 cm) a gradienty (90–240 min) se zvyšuje počet identifikovaných proteinů o ~10 % proti 50 cm kolónám.
• PRM kvantifikace rituximabu v matrici dosahuje LOD na amolové úrovni a vysoké reprodukovatelnosti RT (RSD 0,12 %).
• Ultra-low-flow (10–100 nL/min) prototyp ukázal identifikaci až 2000 proteinů z 10 ng vzorku s RSD RT < 0,2 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Analýza velmi omezeného množství vzorku (laserová mikrodisekce, single-cell proteomics, tumor biopsie).
• Detekce a kvantifikace nízkoabundantních biomarkerů ve složitých matricích.
• Vyšší proteomické krytí a důkladná charakterizace post-translačních modifikací.
• Možnost multiplexovaného sledování cílených proteinů v reálném čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj uživatelsky přívětivých nano-LC systémů s integrovanými konektory a snadnou obsluhou.
• Automatizace a robustní provoz ultranízkých průtoků pro rutinní aplikace.
• Další zvyšování citlivosti pro single-cell omics a metaproteomiku.
• Integrace s novými typy MS detektorů a datově orientovaná analýza velkých dat.

Závěr

Ukázalo se, že volba chromatografického měřítka musí vyvážit citlivost a průtok. Nano-LC-MS je dnes standardem v hluboké proteomice i cílené kvantifikaci. Extrémně nízké průtoky přinášejí nejvyšší citlivost, ale vyžadují pokročilou expertízu a specializované přístroje.

Reference

• Köcher T., et al. Development and performance evaluation of an ultralow-flow nanoliquid chromatography-tandem mass spectrometry set-up. Proteomics. 2014;14:1999–2007.
• Patel N. R., et al. mRNA expression of GAPDH from individual cells. Clin Cancer Res. 2008;doi:10.1158/1078-0432.CCR-07-1497.
• Toriello K., et al. Single-cell proteomics in Jurkat cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105(46):17729–17734.