Real-time, High Density Monitoring of pTyr Signaling Targets in Human Tumors Using Heavy Peptide Triggered Targeted Quantitation

Význam tématu

Proteinová tyrosinová fosforylace (pTyr), ačkoliv tvoří méně než 1 % všech fosforylací, je klíčovým regulátorem buněčných signálních drah spojených s onkogeny. Precizní a reprodukovatelná kvantifikace stovek pTyr lokalit v nádorových vzorcích je zásadní pro pochopení mechanismů nádorové progresivity a vývoj cílených terapií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout univerzální workflow pro absolutní kvantifikaci pTyr signálních komponent, založené na interním standardu (IS) a plně kompatibilní s komerčně dostupným Orbitrap hardwarem. Metoda má umožnit citlivé a vysoce husté sledování stovek pTyr peptidů v jedné LC-MS analýze lidských nádorových vzorků.

Použitá metodika

Extrahované proteiny z kolorektálních nádorových vzorků byly redukovány, alkylovány a štěpeny trypsinem. Do každého vzorku bylo přidáno 1 pmol směsi 356 stabilně izotopově značených pTyr peptidů jako interní standard. Následovalo dvoustupňové obohacení: imunoprecipitace s protilátkami PT66, PY100 a 4G10 a následná metal-affinity chromatografie pomocí Fe-NTA.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie: Thermo Scientific EASY-nLC 1200
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 a Orbitrap Eclipse Tribrid
• Metoda akvizice: SureQuant IS-triggered paralelní reakční monitoring (IS-PRM) s reálným časem detekce
• Software pro analýzu: Skyline

Hlavní výsledky a diskuse

SureQuant workflow umožnil detekci a absolutní kvantifikaci 356 pTyr lokalit na jeden běh LC-MS s vysokou citlivostí a precizností. Dynamické přepínání mezi „watch mode“ (rychlé snímání IS) a „quant mode“ (vysoká rozlišení MS2 endogenních peptidů) zajišťuje optimální sběr dat bez potřeby plánování retenčních časů. V porovnání s tradičním DDA a TMT přístupy byla reproducibilita vyšší než 80 % (oproti < 25 % u TMT) a byla dosažena jednopointová kalibrace pro absolutní stanovení koncentrací.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost paralelního cílení stovek pTyr lokalit v jednom běhu
• Vynikající citlivost a přesnost díky interním standardům
• Absolutní kvantifikace fosfosignatur
• Žádné plánování retenčních časů – plně automatizované řízení akvizice
• Vhodné pro průmyslové QA/QC, biomarkerové studie a farmakodynamiku

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další typy fosforylace (pSer, pThr) a komplexní PTM panely
• Vývoj cílených panelů pro klinické biomarkery a personalizovanou medicínu
• Integrace s automatizovanými platformami a high-throughput screeningem
• Využití ve výzkumu mechanismů rezistence a cílené terapie

Závěr

SureQuant IS-guided workflow stanovuje nový standard pro vysoce hustou, citlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci fosfotyrosinových signálních drah v lidských nádorových vzorcích. Kombinace selektivního obohacení, interních standardů a inteligentního řízení sběru dat umožňuje absolutní kvantifikaci stovek cílových peptidů v jedné analýze.

Reference

• Vasaikar S., Huang C., Wang X., Petyuk V. A., Savage S. R., Wen B. a kol.: Proteogenomic Analysis of Human Colon Cancer Reveals New Therapeutic Opportunities. Cell, 2019.
• Eid S., Turk S., Volkamer A., Rippmann F., Fulle S.: KinMap: a web-based tool for interactive navigation through human kinome data. BMC Bioinformatics, 2017.