Creating High Quality Metabolite Libraries for Fast Metabolomics Screening and Identification

Význam tématu

Identifikace endogenních metabolitů je zásadní pro pokročilé výzkumy v oblasti metabolomiky a biomedicíny. Absence spolehlivé a rozsáhlé referenční knihovny omezuje přesnost metabolického profilování. Vysoce kvalitní knihovna s přesnými hmotnostmi, retenčními časy a MS2 spektry zvyšuje důvěru v jednoznačnou identifikaci a urychluje screening biologických vzorků.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vytvořit komplexní knihovnu 300 komerčně dostupných standardů endogenních metabolitů se zaznamenanými retenčními časy, přesnými hmotnostmi a kvalitními MS2 spektry. Metodika zahrnovala přípravu směsí standardů, akvizici dat v obou ionizačních módech a následnou tvorbu databáze a MS2 spektrálního archivu.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická separace a detekce proběhla na:

• UHPLC systému Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RS
• Kolona Hypersil GOLD C18 (150 × 2,1 mm, 1,9 μm)
• Kapalinová chromatografie s gradientem mobilní fáze (voda/Formiát – metanol/Formiát)
• Cyklované full MS skeny (35 000 rozlišení, pozitivní/negativní režim) a data-dependent MS2 (70 000 rozlišení) na hmotovém spektrometru Thermo Scientific Q Exactive
• Kolizní energie pro MS2 spektra: 10, 30 a 45 eV
• Software pro zpracování dat: Thermo Scientific TraceFinder 3.2

Hlavní výsledky a diskuse

Databáze obsahuje 300 metabolitů s následujícími parametry:

• Přesné monoisotopické hmotnosti a chemické vzorce
• Retenční časy pro daný chromatografický režim
• MS2 spektra při třech kolizních energiích v obou polaritách

Validace knihovny na vzorku ZDF potní plazmy ukázala:

• 252 metabolitů identifikovaných na základě přesné hmotnosti
• 152 metabolitů potvrzených izotopickým vzorcem (100 % shoda)
• 130 metabolitů s odpovídajícím retenčním časem
• 85 metabolitů s úplnou shodou MS2 spektra

Příklad: tryptofan byl detekován s odchylkou 1,7 ppm a maximálním skóringem 100 pro MS2 spektrum.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení redundance kandidátů díky kombinaci 3 kritérií (m/z, RT, MS2)
• Zrychlené a automatizované screenovací workflow
• Vysoká spolehlivost identifikace biologických vzorků pro metabolomické i klinické aplikace

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření knihovny o další třídy metabolitů a lipidů
• Integrace s veřejnými databázemi a multiplatformní platformou pro sdílení spektrálních dat
• Využití v klinickém screeningu, toxikologii a personalizované medicíně

Závěr

Vytvořená LC-MS metabolitová knihovna kombinuje vysoké rozlišení, přesné hmotnosti, retenční časy a kvalitní MS2 spektra. To umožňuje rychlý a spolehlivý screening biologických vzorků s minimální redundancí a vysokou důvěrou v identifikaci.

Reference

1. Metabolomics Fiehn Lab, http://fiehnlab.ucdavis.edu/Metabolite-Library-2007/
2. Xu G., Yin P. Journal of Chromatography A. 2014, 1374, 1–13
3. Human Metabolome Library, http://www.hmdb.ca/hml/metabolites