Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer with UVPD

Význam tématu

Charakterizace biomolekul na úrovni celé molekuly (top-down) a jejích domén (middle-down) přináší detailní informace o primární struktuře a posttranslačních modifikacích, které jsou klíčové pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik. Podobně je lokalizace dvojné vazby v acylových řetězcích lipidů zásadní pro pochopení jejich funkce v biologických systémech. UV fotodynamická disociace (UVPD) rozšiřuje možnosti hmotnostní spektrometrie o unikátní fragmentační kanály, jež dosud nebyly u běžných měkkých metod dostupné.

Cíle a přehled studie

Studie představuje využití Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometru s UVPD aktivací pro dvě klíčové aplikace: kvalitativní a kvantitativní mapování sekvence monoclonálních protilátek a lokalizaci dvojných vazeb v triacylglycerolech. Cílem bylo porovnat UVPD s elektronovou (ETD) a hybridní (EThcD) aktivací a prokázat jeho přínos v oblasti lipidové strukturní eluci­dace.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer vybavený klasou 1 213 nm CryLaS laserem (2,5 kHz, >1,2 μJ/pulz) pro UVPD, dvou­tlaký lineární iontový past, analyzátory Orbitrap a iontový trap.
• Monoklonální protilátky: enzymová digesce a redukce, reverzní fázová chromatografie pro oddělení domén (Fd, lehký řetězec, Fc/2).
• Fragmentační režimy: UVPD, ETD, EThcD, kolizní disociace (CID, HCD) pro srovnání.
• Lipidy: addukce lithiem, UVPD MS2 spektra trojné esterifikace glycerolových molekul (TG 16:0/16:0/18:1).

Hlavní výsledky a diskuse

• Antibody sequencing: UVPD poskytlo 61,2 % pokrytí sekvence domény Fc/2, 50,9 % lehkého řetězce a 38,5 % Fd. ETD a EThcD dodatně přispívají pokrytím až 59,8 % a 53,3 % pro jednotlivé domény.
• Kombinace fragmentací ETD, EThcD a UVPD zvýšila celkové pokrytí vazeb na 86,6 % pro Fc/2, 79,7 % pro lehký řetězec a 72 % pro Fd.
• Unikátní informace: UVPD přineslo 20,4 % jedinečného pokrytí pro Fc/2, 20,7 % pro LC a 19,8 % pro Fd oproti ostatním metodám.
• Lipidová analýza: UVPD MS2 spektrum trojného lipidu odhalilo diagnostické fragmenty při m/z 557,512; 583,527; 599,522; 701,627; 725,627, které umožňují jednoznačnou lokalizaci dvojné vazby a identifikaci acylových řetězců.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší spolehlivost a úplnost sekvenční analýzy bioterapeutik bez nutnosti štěpení na malé peptide.
• Možnost mapovat posttranslační modifikace a varianty glykozylace intactních protilátek.
• Komplexní lipidová struktura: přesné určení polohy nasycení a identifikace izomerů v komplexních směsích.
• Flexibilní přepínání mezi fragmentačními režimy v jednom přístroji pro širší spektrum aplikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace UVPD s zobrazovacími hmotnostními spektrometry pro prostorovou distribuci modifikací v tkáních.
• Rozvoj software pro rychlé anotace UVPD spekter a kombinované datové interpretace z více režimů fragmentace.
• Aplikace UVPD na další třídy biomolekul, např. sacharidy či komplexní proteiny s vysokou hmotností.
• Automatizované platformy pro vysoko přenosovou bioterapeutickou kontrolu kvality.

Závěr

Orbitrap Fusion Lumos s UVPD aktivací představuje průlom v analytické chemii pro detailní charakterizaci intactních protilátek i lipidů. Díky komplementárním fragmentačním režimům dosahuje vysoké sekvenční pokrytí i strukturních detailů, což významně rozšiřuje možnosti výzkumu a průmyslové aplikace v oblasti bioterapeutik a lipidomiky.

Reference

• Fornelli et al., TP 087, ASMS 2017
• Reid G., University of Melbourne, komentář k UVPD pro lipidovou analýzu