Incorporating CCS values to enable 4-dimensional annotation of metabolic features

Význam tématu

Analytická identifikace metabolitů v LC-MS/MS vyžaduje přesné určení více parametrů, přičemž iontová mobilita a měřená kolizní průřezová plocha (CCS) doplňují tradiční rozměry a zvyšují spolehlivost anotací metabolitů.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl:

• Ověřit reprodukovatelnost naměřených CCS hodnot v rámci jedné laboratoře i mezi dvěma pracovišti (Bremen a Perth).
• Srovnat experimentálně naměřené CCS hodnoty s literárními daty z Unified CCS Compendium.
• Uplatnit CCS filtry při 4D anotaci metabolitů na příkladu srovnání dvou vzorků moči.

Použitá metodika a instrumentace

• Iontová mobilita: Trapped ion mobility spectrometrie (TIMS) na přístrojích timsTOF Pro s technologií PASEF.
• Ionizace: Apollo II ESI zdroj v pozitivním (4500 V) a negativním módu (4200 V).
• UHPLC: Elute UHPLC (Bremen) a Waters I-Class (Perth) se C18 kolonkou 2.1×100 mm a Van Guard předkolonkou.
• Mobilní fáze: A – voda s 0,1 % kyseliny mravenčí, B – acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí, gradient 1–99 % B.
• Detekce: MS sken 20–1000 m/z, PASEF MS/MS s kolizní energií 20/50 eV, interní kalibrace a mobility kalibrace pomocí Agilent TuneMix.
• Příprava vzorku: centrifugace a filtrace moči, deproteinace metanolem, doplnění solventu A.
• Zpracování dat: MetaboScape 2021, anotace na základě pěti kritérií (hmotnost, retenční čas, izotopický vzorec, MS/MS skóre, CCS).

Hlavní výsledky a diskuse

• Reprodukovatelnost CCS: v rámci jedné laboratoře SD < 0,4 Å2, mezi laboratořemi rozdíl < 0,3 %; průměrné |∆CCS| oproti Unified CCS Compendium < 1 %.
• Stabilita: CV CCS 0,11 % oproti CV retenčního času 0,25 %.
• Anotace: Iontová mobilita čistí MS/MS spektra, zvyšuje kvalitu identifikace (demonstrováno na paraxanthinu).
• Komparace vzorků moči: PCA odhalila rozdíly v xanthinových metabolitech (kofein, paraxanthin, theobromin) s fold-change až 20× podle konzumace kávy.

Přínosy a praktické využití metody

• 4D anotace: CCS jako klíčový filtr zvyšuje selektivitu a snižuje falešná pozitiva.
• Standardizace: shoda mezi pracovišti umožňuje porovnání dat bez rozsáhlých korekcí retenčního času.
• Aplikace: metabolomické studie, QA/QC, průmyslová analytika, fenotypování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření CCS databází pro širší spektrum metabolitů.
• Automatizace kalibrace a aktualizace knihoven v reálném čase.
• Integrace iontové mobility do klinických a high-throughput platforem.
• Využití umělé inteligence pro predikci CCS a optimalizaci analytických postupů.

Závěr

Měření CCS na TIMS-PASEF platformě prokázalo vysokou spolehlivost a reprodukovatelnost a umožnilo robustní 4-rozměrné filtrování anotací metabolitů. CCS hodnoty se osvědčily jako klíčový parametr zvyšující jistotu identifikace v LC-MS/MS metabolomice.

Reference

• Schweiger-Hufnagel U., Szesny M., Barsch A. et al. Bruker Daltonik GmbH a Australian National Phenome Centre, 2020.
• Unified CCS Compendium, McLean Research Group, online databáze.
• MetaboScape 2021 User Manual, Bruker Daltonik GmbH.