Improved Metabolite Identification Using Data Independent Analysis for Metabolomics

Význam tématu

Data independent acquisition pomocí SWATH představuje průlom v neznámé metabolomice díky zajištění kompletního pokrytí MS a MS/MS spekter všech detekovatelných látek v komplexních biologických vzorcích v jediném injekčním běhu. Na rozdíl od dat dependent acquisition, kde je výběr iontů pro fragmentaci náhodný a často vyžaduje vícenásobné analýzy, SWATH umožňuje konzistentní zachycení signálu i nízkointenzivních látek, což významně zvyšuje kvalitu i hloubku identifikace metabolitů.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává výkonnost dat dependent acquisition (DDA) a data independent acquisition (DIA) pomocí variable window SWATH na systému TripleTOF 6600 při analýze lidské plazmy. Cílem bylo kvantifikovat rozdíly v počtu identifikovaných metabolitů a ověřit účinnost vyhledávání proti různě rozsáhlým MS/MS knihovnám (NIST 17, MoNA, METLIN, SCIEX All-in-One).

Použitá metodika

Sample preparation zahrnovalo extrakci metabolitů z 100 µl plazmy s metanolem, centrifugaci, vysušení a rekonstituci ve vodě. Chromatografie probíhala na ExionLC AD se stacionární fází Phenomenex Kinetex F5 v gradientu vodní fáze s 0.1 % kyselinou mravenčí a acetonitrilem s kyselinou. TOF MS data byla sbírána v rozsahu 50–1000 m/z s akumulací 100 ms.

V DDA režimu byl použit top 20 fragmentační watchdog se 25 ms na jednu spektrum a dynamickým řízením pozadí. Ve SWATH režimu bylo využito 20 variabilních Q1 oken optimalizovaných podle iontové hustoty z předběžné analýzy, každé spektrum s 25 ms akumulací a ustáleným cyklem 651 ms.

Použitá instrumentace

• ExionLC AD HPLC system
• Phenomenex Kinetex F5 kolona 150×2.1 mm, 2.6 µm
• TripleTOF 6600 QTOF se zdrojem DuoSpray a ESI v pozitivním módu
• Software SCIEX OS pro nenásledné vyhledávání špiček a library matching

Hlavní výsledky a diskuse

SWATH přinesl identifikaci 628 unikátních sloučenin z jediné injekce, což je o 266 více než 362 detekovaných metodou DDA. Porovnání různých knihoven ukázalo, že rozsáhlejší databáze zvyšují počet nálezů, ale i mezi specializovanými zdroji (METLIN, MoNA, SCIEX AMMSL) existují významné rozdíly v pokrytí metabolitů. Za zmínku stojí identifikace neendogenních látek, např. citrusových alkaloidů, díky širším knihovnám.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní zachycení kvality i kvantity metabolitů v jediném běhu
• Vysoká reprodukovatelnost oproti DDA
• Zvýšená schopnost detekce nízkointenzivních a neočekávaných sloučenin
• Uplatnění v biomarker discovery, QA/QC, klinické metabolomice

Budoucí trendy a možnosti využití

Při dalším rozvoji lze očekávat integraci rozsáhlých otevřených knihoven, strojového učení pro automatizovanou anotaci i spojení se strukturálními daty z iontové mobility. Real-time monitoring kvality vzorků a rozšíření do exposomu či metabolických toků představují perspektivní směry aplikace SWATH ve vysoce citlivé bioanalytice.

Závěr

SWATH acquisition na TripleTOF 6600 výrazně rozšiřuje počet identifikovaných metabolitů oproti optimalizovanému DDA díky jednotnému pořízení MS/MS spekter všech látek. Výběr knihoven významně ovlivňuje výsledky, přičemž širší zdroje odhalují i neendogenní analýty. Tato metoda představuje spolehlivý nástroj pro komplexní necílenou metabolomiku.

Reference

1. Improved Data Quality Using Variable Q1 Window Widths in SWATH Acquisition SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-2879-B
2. SWATH Acquisition Improves Metabolite Coverage over Traditional Data Dependent Techniques for Untargeted Metabolomics SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-7128A
3. SWATH Acquisition Variable Window Calculator SCIEX software support documentation