Simple, Fast and Robust Method for Plasmid Purity Testing and Degradation Monitoring

Význam tématu

Plazmidová DNA je klíčová v oblasti genové terapie, vakcín a přípravy virových vektorů. Vyšší obsah superstočené formy (>80 %) je standardem pro uvolnění hromadných přípravků dle FDA. Tradiční agarózové gely jsou časově náročné a neumožňují automatizaci. Capilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescencí poskytuje rychlou, citlivou a reprodukovatelnou alternativu pro stanovení izoform plazmidů.

Cíle a přehled studie

Předložená technická poznámka popisuje jednoduchou, rychlou a robustní metodu CE-LIF pro separaci a kvantifikaci tří izoform plazmidů (superstočená, lineární a otevřená kruhová) o velikosti 5 a 7 kb. Metoda dosahuje baseline rozlišení do 12–15 minut, minimální manipulace a vysokou opakovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnuje:

• Přípravu gelu z eCAP dsDNA 1000 kitu na bázi polyakrylamidu a jeho 1:10 ředění v 1× TBE
• Označení gelu LIFluor EnhanCE činidlem pro fluorescenční detekci
• Přípravu kontrolních vzorků: lineárního plazmidu řezáním jedním restrikčním místem a otevřené kruhové formy nickovací enzymovou reakcí
• Kalibraci detektoru LIF pomocí kalibračního test mixu a vizuální udržení konců kapiláry ve vodě
• Nastavení časových programů pro kondicionování, separaci a vypnutí instrumentu

Instrumentace:

• PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System s excitací 488 nm a emisní filtrací při 520 nm
• Software 32 Karat verze 10 pro akvizici a analýzu dat

Hlavní výsledky a diskuse

Separační metoda poskytla baseline rozlišení všech tří izoform pro 5 kb a 7 kb plazmidy. U 5 kb plazmidu vedlo 1:10 ředění gelu k rychlému rozdělení superstočené formy, otevřené kruhové formy a lineární formy s odlišnou migrací oproti slab-gel. Kontrolní experimenty potvrdily průkaz degradace plazmidu a správné přiřazení píků. U 7 kb plazmidu byla čitelná velmi nízká hladina otevřené kruhové formy a lineární formy nebyly přítomny v nezaopatřeném vzorku.
Robustnost a opakovatelnost byla ověřena 18 opakovanými běhy 5 kb vzorku. Relativní standardní odchylka migrace superstočené formy dosáhla 0,23 % a pro procento plochy 0,61 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý čas analýzy do 12 minut
• Automatizované dávkování vzorků a vyhodnocení dat
• Vysoká citlivost, reprodukovatelnost a přesná kvantifikace izoform
• Snížená produkce odpadu oproti agarózovým gelům
• Vhodné pro QA/QC v biotechnologických a farmaceutických laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze optimalizovat pro plazmidy větší než 7 kb úpravou ředění gelu. Rozšíření aplikace na jiné typy nukleových kyselin a monitoring stability v průběhu výroby vektorů genové terapie představuje perspektivní oblast. Dále se otevírá prostor pro plně integrováné systémy s vyšší automatizací a multiplexní detekcí různých typů vektorů.

Závěr

Navržená CE-LIF metoda umožňuje rychlé, citlivé a přesné stanovení plazmidových izoform s vysokou opakovatelností. Díky dostupným kitům a jednoduchému nastavení nabízí plně automatizované řešení pro kontrolu kvality plazmidů v špičkových laboratořích.

Reference

1. FDA Points to consider on plasmid DNA vaccines for preventive infectious diseases. 1996. Docket no 96N-0400.
2. Boardman C. a Dewald H. Plasmid purity and heterogeneity analysis by capillary electrophoresis. Poster at MSB 2010.