Sensitive Quantification of Therapeutic Oligonucleotides Extracted from Plasma

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie, včetně antisense oligonukleotidů (ASO) a siRNA, představují pokročilý přístup k cílené léčbě mnoha dosud neléčitelných onemocnění. Pro hodnocení farmakokinetiky a metabolismu je nezbytná vysoce citlivá a specifická bioanalytická metoda, která dokáže rozlišit plnou délku produktu od metabolitů a nečistot.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci stereopurového fosforotioátového 20merového ASO extrahovaného z lidské plazmy. Data byla získána na systému SCIEX QTRAP® 6500+ s využitím lineárního iontového pastu (LIT) pro rychlý vývoj metody a MRM workflow pro kvantifikaci.

Použitá instrumentace

Agilent 1290 Infinity UHPLC s kolonkou Phenomenex Clarity Oligo-XT (2,1×50 mm, 2,6 µm)
SCIEX QTRAP 6500+ LC-MS/MS s IonDrive™ QJet a Turbo V zdrojem
Software SCIEX OS-Q (Explorer, Bio Tool Kit, Analytics)

Metodika

• Příprava vzorku: dvojitá extrakce plazmy (LLE) s fenol:chloroform:isoamyl alkoholem, následné vysušení a rekonstituce v roztoku EDTA.
• Chromatografie: mobilní fáze A i B obsahují 15 mM DIEA a 100 mM HFIP ve vodě/methanolu; gradient 85→10→85 % vody; 60 °C; 300 µL/min; objem injekce 15 µL.
• Hmotnostní spektrometrie: negativní ionizace; IDA workflow s EMS skenem (600–2000 m/z) a EPI skenem pro identifikaci fragmentů; MRM přechody pro -10 a -9 nábojové stavy (Q1/Q3, např. 716,6→392,1 m/z).

Hlavní výsledky a diskuse

On-column optimalizace využívající LIT zkrátila vývoj metody. EPI sken přinesl až 15× vyšší signál a lepší rozlišení fragmentů oproti klasickému PI. Kalibrační křivka v rozsahu 0,2–1000 ng/mL byla lineární (r=0,99496) s LLOQ 0,2 ng/mL v plazmě. Přesnost a opakovatelnost QC vzorků splnily kritéria ≤15 % (20 % pro LLOQ).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje specifickou, citlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci ASO v biologických matricích. Je vhodná pro farmakokinetické a toxikokinetické studie, vývoj a kontrolu kvality oligonukleotidových léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj směruje k automatizaci přípravy vzorků, rozšíření metodiky na multi-analyty, rozbor metabolitů a integraci do studií biodistribuce genových terapií. Rostoucí význam stereopure modifikací vyžaduje adaptaci metod pro detailní charakterizaci.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS platforma QTRAP 6500+ s využitím LIT, IDA a MRM přináší robustní a vysoce citlivou analýzu terapeutických oligonukleotidů v komplexních vzorcích s LLOQ na úrovni 200 pg/mL. Metoda splňuje požadavky na farmakokinetické hodnocení a podporuje vývoj inovativních genových terapií.

Reference

• Iwamoto N. et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nat. Biotechnol. 2017;35(9):845-851.