Determination of inborn errors of metabolism

Význam tématu

Analýza aminokyselin a acylkarnitinů v suchých kapkách krve je základem screeningu novorozenců na vrozené metabolické vady. Rychlá a spolehlivá kvantifikace těchto biomarkerů umožňuje včasnou diagnostiku a zahájení léčby, čímž výrazně zlepšuje prognózu pacientů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo zavést metodu FIA-MS/MS pro současnou kvantifikaci 13 aminokyselin a 13 acylkarnitinů v suchých kapkách krve (DBS) v rámci klinického výzkumu vrozených poruch metabolismu.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex Binary UHPLC (Thermo Scientific)
• TSQ Fortis triple-stage kvadrupólový hmotnostní spektrometr s HESI v pozitivním ionizačním módu
• MassChrom LC-MS/MS Complete Kit pro aminokyseliny a acylkarnitiny v DBS (Chromsystems)

Metodika

• Příprava vzorku: 3,2 mm disk z DBS, extrakce 100 µl činidla s interními standardy, třepání 600 rpm po dobu 20 min a přenos extraktu.
• Flow injection analysis (FIA): objem injekce 10 µl, mobilní fáze a parametry průtoku 0,09–0,30 ml/min, runtime 1,5 min.
• MS/MS detekce: SRM režim, nastavení zdroje (vaporizer 150 °C, kapilára 300 °C, spray 3500 V, plynné parametry) a optimalizované SRM přechody s kolizní energií a napětím na tubovém čočce.
• Vyhodnocení výkonu: intra- a inter-assay přesnost (%CV) a analytická přesnost (bias) na kontrolních vzorcích ve dvou koncentracích.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intra-assay CV pro většinu analyzátů <9 %, inter-assay CV <12,5 % (C5DC do 17,7 %).
• Analytický bias v rozsahu -12,8 % až +11,8 %, splňující požadavky dodavatele.
• Reprezentativní SRM profily fenylalaninu a acetylkarnitinu potvrdily vysokou selektivitu a citlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza 26 sloučenin za jedinou injekci s časem 1,5 minuty.
• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost vhodná pro klinický výzkum a rozšířený screening.
• Standardizovaný kit usnadňuje srovnávání výsledků mezi laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zařazení dalších metabolických markerů a rozšíření panelu pro komplexnější screening.
• Automatizace přípravy vzorku a integrace pokročilých algoritmů pro zpracování dat.
• Přizpůsobení metodiky novým MS platformám s vyšším rozlišením a miniaturizovanými systémy pro bod-of-care testing.

Závěr

Použitá FIA-MS/MS metoda s TSQ Fortis se ukázala jako spolehlivá a citlivá pro kvantifikaci aminokyselin a acylkarnitinů v DBS. Splňuje požadavky klinického výzkumu vrozených metabolických vad a nabízí rychlý a reprodukovatelný přístup pro screening a studium inborn errors of metabolism.

Reference

1. Lemonde H. Pediatr. Child Health, 2014, 25, 103–107.
2. Marca G. J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 101, 174–182.
3. Lund A. M. Mol. Genet. Metab., 2012, 107, 281–293.
4. Sandlers Y. Transl. Res., 2017, 189, 65–75.