Automation of Sample Derivatization Using the Agilent 1260 Infinity II Prime LC System for Amino Acid Analysis

Význam tématu

Aminokyselinová analýza je klíčová pro strukturální a funkční charakterizaci bílkovin a hodnocení nutriční kvality potravin a nápojů. Rychlá a přesná detekce těchto sloučenin podporuje výzkum, průmyslové procesy i kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vytvořit plně automatizovaný postup derivatizace aminokyselin a jejich následné separace a detekce na systému Agilent 1260 Infinity II Prime LC-FLD. Metoda byla validována na standardní směsi 23 aminokyselin a otestována na vzorcích soft drinku a červeného vína.

Použitá metodika a instrumentace

• In-loop předkolonková derivatizace OPA pro primární a FMOC pro sekundární aminy v autosampleru.
• Reverzní chromatografie na kolonce AdvanceBio AAA (3,0×100 mm, 2,7 µm) s gradientním průtokem 1,2 mL/min: 2 %→57 % organické fáze (0,2–6,8 min), vyprání 100 % B (7,0–7,4 min) a návrat na 2 % B do 9 min.
• Fluorescenční detektor s vícenásobnými emisními vlnovými délkami 455 nm pro OPA a 315 nm pro FMOC a přepínanou excitací 345→265 nm.
• Program jehly s mytím po každém kroku pro omezení carry-over a stabilní pH podmínky pro maximální výtěžek derivatizace.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Prime LC System
• Agilent 1260 Infinity II Flexible Pump
• Agilent 1260 Infinity II Multisampler
• Agilent 1260 Infinity II Multicolumn Thermostat
• Agilent 1260 Infinity II Fluorescence Detector Spectra
• Software OpenLab CDS

Hlavní výsledky a diskuse

• Rychlá separace 23 aminokyselin do 9 min při maximálním tlaku 510 bar.
• Vysoká reprodukovatelnost derivatizace: plošná RSD < 1 % (n=10) a RSD RT < 0,1 %.
• Senzitivita detekce: LOD 0,225–2,25 pmol/µL, linearita kalibrace R² ≥ 0,9985.
• Analýza vzorků soft drinku a červeného vína potvrdila robustnost metody a nutnost optimalizace PMT zesílení podle koncentrace aminokyselin.

Přínosy a praktické využití metody

• Úplná automatizace derivatizace a separace šetří čas a minimalizuje chyby obsluhy.
• Krátký analytický cyklus zvyšuje kapacitu laboratoře a snižuje náklady na analýzu.
• Metoda je vhodná pro rutinní QA/QC v potravinářském průmyslu i pro akademický výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Spojení s hmotnostní spektrometrií pro rozšíření detekční schopnosti a selektivity.
• Dopracování derivatizačních protokolů pro vysokopropustné systémy a miniaturizaci.
• Adaptace na různé komplexní matrice včetně biologických a environmentálních vzorků.

Závěr

Popsaná metoda na platformě Agilent 1260 Infinity II Prime poskytuje rychlou, citlivou a vysoce reprodukovatelnou analýzu 23 aminokyselin ve vzorcích potravin a nápojů. Splňuje nároky na vysokou propustnost a spolehlivost v rutinní i výzkumné praxi.

Reference

1. Schuster R. Determination of Amino Acids in Biological, Pharmaceutical, Plant and Food Samples by Automated Precolumn Derivatization and High-Performance Liquid Chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 1988;431:271–284.
2. Davidson I. Hydrolysis of Samples for Amino Acid Analysis. Methods in Molecular Biology - Protein Sequencing Protocols. 2nd ed. Totowa: Humana Press; 2003.
3. Hitchcock J. Analysis of Amino Acids in Animal Feed Matrices Using the Ultivo Triple Quadrupole LC/MS System. Agilent Technologies application note. 2019.
4. Long D. Rapid Method for Proline Determination in Grape Juice and Wine. J Agric Food Chem. 2012;60(17):4259–4264.