Lipid Profiling Workflow Demonstrates Disrupted Lipogenesis Induced with Drug Treatment in Leukemia Cells

Význam tématu

Lipidomika nabízí hluboký vhled do buněčného metabolismu tuků, umožňuje identifikovat změny v biosyntéze lipidů v závislosti na farmakologické intervenci a odhalit potenciální biomarkery účinnosti či toxicity léčiv. V kontextu akutní myeloidní leukémie (AML) je cílem mapování lipidového profilu pochopit mechanismy antineoplastických látek a podpořit vývoj cílených terapií.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo aplikovat komplexní lipidomickou workflow Agilent na kultury AML buněk K562 po 24hodinové expozici lipid-modulačnímu kombinovanému léku BaP (bezafibrát + medroxyprogesteronacetát) a porovnat výsledný lipidom s účinky jednotlivých složek (BEZ, MPA) a kontrolou. Studie měla za úkol potvrdit dřívější zjištění o potlačení lipogeneze BaP a rozšířit spektrum detekovaných lipidů a izomerů.

Použitá metodika a instrumentace

Buňky K562 byly kultivovány v RPMI médiu a po ošetření léky se prováděla extrakce lipidů modifikovanou Folchovou metodou (chloroform/methanol/voda). Roztoky byly fázově odděleny, extrakty vysušeny a znovu rozpuštěny před analýzou.

• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II LC se sloupci Poroshell 120 EC-C18 (3,0×100 mm, 2,7 µm), teplota 50 °C, gradient organicko-vodné směsi s amoniovým acetátem a fluoridem.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6546 LC/Q-TOF s technologií Jet Stream, získávání dat v režimu AutoMS/MS (Iterative MS/MS) a MS-only režimu v obou ionizačních polaritách.
• Software: MassHunter Q-TOF Data Acquisition 10.0, MassHunter Lipid Annotator 1.0, Profinder 10.0 pro extrakci dat, Mass Profiler Professional 15.1 pro statistiku, PCDL Manager B.08 SP1 pro správu knihoven.

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí Lipid Annotator bylo v bazálním extraktu identifikováno 430 lipidů v pozitivním a 653 v negativním ionizačním módu napříč 17 a 25 třídami lipidů. Cílená analýza pomocí Profinder a MPP ukázala:

• Výraznou separaci skupin (BEZ, MPA, BaP, kontrola) v PCA a shlukové analýze, přičemž BEZ významně přispívá k efektu kombinace BaP.
• Statisticky významné zvýšení triacylglycerolů (TG) a snížení diacylglycerolů (DG) při BaP (p<0,001), potvrzující blok lipogeneze na úrovni acylace.
• Změny dalších lipidových tříd, např. nárůst ceramidů (Cer_NS, HexCer_NS), lyso-fosfoglycerolů (LPE, LPG), pokles fosfatidylcholinu (PC), fosfatidylinositolů (PI), oxidovaných forem PC a PI.
• Chromatografické rozlišení a kvantifikace izomerů Cer_NS 42:2 (d18:1_24:1 vs. d18:2_24:0) s opačnou odezvou na BaP, prokazující detekci strukturně blízkých molekul.
• V nevyhraněné (untargeted) analýze odhalený dosud málo popsaný C2 ceramid (d18:2_2:0) s téměř čtyřnásobným nárůstem při BaP, potvrzený KMD analýzou a MS/MS fragmenty.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow spojuje cílenou i necílenou lipidomiku, umožňuje rychlou a hlubokou anotaci lipidů, rozlišení izomerů a detekci nízkomolekulárních atypických lipidů. Tento přístup je použitelný pro farmakologický výzkum, QA/QC v biotechnologických laboratořích a identifikaci lipidových biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření integrace lipidomiky s genomikou a proteomikou, použití umělé inteligence pro automatizovanou interpretaci dat a zrychlení personalizovaných medicínských studií. Dále se rozvíjí metody ion mobility spektrometrie pro lepší rozlišení izomerů a kvantitativní přístupy na bázi standardů stabilních izotopů.

Závěr

Aplikační poznámka dokazuje, že kombinace LC/Q-TOF Agilent 6546, Iterative MS/MS a Lipid Annotator softwaru poskytuje rozsáhlou a citlivou platformu pro studium lipidomických změn v buňkách AML pod farmakologickým tlakem. Workflow je vhodný pro hlubokou charakterizaci lipidů, odhalování účinků léčiv a objev nových molekulárních cílů.

Reference

• Southam AD et al. Drug Redeployment to Kill Leukemia and Lymphoma Cells by Disrupting SCD1-Mediated Synthesis of Monounsaturated Fatty Acids. Cancer Res. 2015;75(12):2530–2540.
• Sartain M et al. Improving Coverage of the Plasma Lipidome Using Iterative MS/MS Data Acquisition Combined with Lipid Annotator and 6546 LC/Q-TOF. Agilent Technologies Application Note 5991-0775EN, 2019.
• MassHunter Profinder: Batch Processing for High-Quality Feature Extraction of Mass Spectrometry Data. Agilent Technologies Technical Overview 5991-3947EN, 2014.
• Lipidomics Analysis with Lipid Annotator and Mass Profiler Professional. Agilent Technologies Technical Overview 5994-1111EN, 2019.
• Snyder F et al. Biosynthesis of N-Acetylsphingosine by Platelet-activating Factor: Sphingosine CoA-independent Transacetylase in HL-60 Cells. J Biol Chem. 1996;271(1):209–217.
• Hannun YA et al. Programmed Cell Death Induced by Ceramide. Science. 1993;259(5102):1769–1771.