Amino acid analysis of mammalian cell culture medium by liquid chromatography with UV and fluorescence detection and derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate

Význam tématu

Aminoacidová analýza průmyslových a laboratorních kultur savčích buněk je klíčová pro optimalizaci produkce biotechnologicky významných proteinů. Přehledná a spolehlivá metoda sledování volných aminokyselin v reálném čase napomáhá řízení výživy kultury, zkracuje cykly testování a zvyšuje výtěžnost cílových biomolekul.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ověřit předstupňové značení aminokyselin reaktivem 6-aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylkarbamát (AQC) a jejich separaci pomocí reverzní fáze UHPLC s UV a fluorescence detekcí. Studie zahrnovala:

• Validaci linearity, přesnosti a přesné opakovatelnosti metody
• Sledování stability a životnosti kolon po více než 2000 vstupech
• Analýzu vzorků sérum-volného kultivačního média z CHO bioreaktoru během produkce monoklonální protilátky

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky kultivačního média se 100× naředily ultrapure vodou, filtrovaly a promíchaly v borátovém pufru (pH 8,5). Pre-column derivatizace se prováděla přidáním AQC v acetonitrilu, zahřátím při 55 °C po dobu 10 minut a následným ochlazením. Derivatizované aminokyseliny se separovaly na kolóně C18 (2,1×150 mm, 2,2 µm) při 45 °C gradientem amonného formiátu (pH 2,9) a acetonitrilu. Detekce probíhala UV při 260 nm a fluorescence (ex 266 nm, em 473 nm). Kalibrace zahrnovala osm úrovní od 2,5 do 250 pmol/µL s vynikající liniaritou (R2 >0,999).

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Flex (binary či quaternary pumpa, autosampler, column compartment)
• C18 kolona Acclaim Vanquish C18, 2,1×150 mm, 2,2 µm
• Fluorescenční detektor Vanquish FLD a UV/VIS detektor Vanquish VWD
• Digitální sušicí lázeň, centrifuga, pH metr, pipety s nízkým adsorpčním efektem

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala robustní opakovatelnost: retence klíčového páru Gly-Arg s RSD ≤1,0 % a plocha špičky RSD ≤3,5 %. Životnost kolon překročila 2000 injekcí při zachování rozlišení většiny aminokyselin nad 1,2. Lineární kalibrace vykázala R2 ≥0,999 pro 22 derivatizovaných aminokyselin, detekční limity umožňují spolehlivou kvantifikaci v rozsahu 2,5–250 pmol/µL. Příklad analýzy vzorků z bioreaktoru ukázal spotřebu glutaminu a modifikaci profilu aminokyselin během času kultivace.

Přínosy a praktické využití metody

• Nižší investiční i provozní náklady ve srovnání s metodami založenými na hmotnostní spektrometrii
• Jednoduchá příprava reagentů a vzorků, bez nutnosti složitého enzymatického štěpení
• Dlouhodobá spolehlivost umožňuje plánovanou kontrolu kvality v bioprocesu
• Modulární použitá instrumentace zcela pokrývá běžné požadavky laboratoří QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření online vzorkovačů a automatizace přípravy vzorků, které umožní kontinuální monitoring. Možné je také kombinovat derivatizaci AQC s hmotnostní spektrometrií pro rozšíření analýzy modifikovaných aminokyselin. Dále se předpokládá zkrácení doby analýzy optimalizací gradientu a využitím kolony s vyšším tlakem.

Závěr

Popsaná metoda předstupňové derivatizace AQC a UHPLC detekce představuje spolehlivý, citlivý a přehlédnutelný nástroj pro rutinní analýzu volných aminokyselin v kultivačních médiích a dalších biologických matricích. Její dlouhodobá životnost, reprodukovatelnost a nízká cena ji předurčují k širokému užití v biotechnologii i potravinářství.

Reference

• 1. Cohen S.A., Michaud D.P. Synthesis of a fluorescent derivatizing reagent, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, Anal. Biochem. 1993, 211:279–287.
• 2. Reverter M., Lundh T., Lindberg J.E. Determination of free amino acids in pig plasma by precolumn derivatization with AQC, J. Chromatogr. B 1998, 696:1–8.
• 3. HPLC Method Transfer Calculator, Thermo Fisher Scientific.