Optimized Search Strategy to Maximize PTM Characterization and Protein Coverage in Proteome Discoverer Software

Význam tématu

Komplexní charakterizace proteomů a přesné kvantifikace proteinů jsou základem pro pochopení biologických procesů a identifikaci biomarkerů. Optimalizace vyhledávacích strategií v LC-MS/MS datech zvyšuje spolehlivost identifikací peptidů, proteinů a jejich PTM, což je klíčové pro aplikace v výzkumu, QA/QC i průmyslové analytice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkonnost běžně používaných vyhledávacích algoritmů (SEQUEST, Mascot, Byonic, MS Amanda v Proteome Discoverer 2.0 a Andromeda v MaxQuant 1.5) na dvou modelových sadách: standardní HeLa peptidická směs a komplexní histony s četnými modifikacemi. Hodnoceny byly počty identifikací, kvalita PTM lokalizace a doba analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza HeLa (200 ng) proběhla na Q Exactive Plus spojeném s EASY-nLC 1000 a 50 cm kolonkou (70 000 MS1, 17 500 MS2). Histonový vzorek (1 µg) byl analyzován na Orbitrap Fusion Tribrid (120 000 MS1, rychlé MS2). Vyhledávací parametry zahrnovaly toleranci 10 ppm (prekurzor) a 0,02 Da (HCD) nebo 0,6 Da (CID), statické i dynamické modifikace dle typu vzorku a kontrolu FDR (1 % peptidů, 2 % proteinů). Data zpracována v Proteome Discoverer 2.0 a MaxQuant 1.5.2.8 na standardním PC.

Hlavní výsledky a diskuse

• HeLa: Byonic s protein-aware FDR (2D) dosáhl o ~7 000 více peptidů než ostatní, Sequest HT byl nejrychlejší (21 min), Byonic a Mascot ~34–36 min.
• FDR filtry: 2D FDR zachovává vysokou citlivost bez výrazného snížení přesnosti, přísnější 1D FDR vede ke ztrátě kvalitních identifikací.
• Histony: značné rozdíly ve vyhledávání PTM. Byonic a Mascot produkovaly více modifikovaných peptidů, MaxQuant vykazoval nejvíce proteinových skupin.
• Srovnání PSM ukázalo, že unikátní identifikace každého enginu mohou být kvalitní, proto se doporučuje kombinovat více vyhledávačů.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované nastavení parametrů a využití paralelního zpracování v Proteome Discoverer 2.0 umožňuje získat maximální proteomické pokrytí a rychlou odezvu ve workflow pro rutinní analýzy i výzkum post-translačních modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace více vyhledávacích enginů pro zvýšení pokrytí proteomu a modulární workflow.
• Další zrychlování analýzy pomocí vícevláknového zpracování a cloudových výpočetních prostředí.
• Využití strojového učení pro preciznější scoring peptid-spectrum match a lokalizaci PTM.

Závěr

Pro rychlé screeningové analýzy vzorků je vhodný Sequest HT, pro maximální citlivost a detailní mapování PTM pak Byonic s protein-aware FDR. U komplexně modifikovaných proteinů je nejefektivnější kombinovat více vyhledávačů v rámci paralelního workflow Proteome Discoverer 2.0.

Reference

• Eng J.; McCormack A. L.; Yates J. R. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994, 5, 976–989.
• Perkins D. N.; Pappin D. J.; Creasy D. M.; Cottrell J. S. Electrophoresis 1999, 20, 3551–3567.
• Cox J.; Mann M. Nat. Biotechnol. 2008, 26, 1367–1372.
• Bern M.; Kil Y. J. J. Proteome Res. 2012, 10, 5296–5301.
• Dorfer V.; Pichler P.; Stranzl T.; Stadlmann J.; Taus T.; Winkler S.; Mechtler K. J. Proteome Res. 2014, 13(8), 3679.
• Shteynberg D.; Nesvizhskii A.; Moritz R.; Deutsch E. Mol. Cell Proteomics 2013, 12, 2383–2393.
• Kapp E. A. et al. Proteomics 2005, 5, 3475–3490.
• Yuan Z.; Lin S.; Molden R.; Garcia B. J. Proteome Res. 2014, 13, 4470–4478.