VITATOX: Stanovení alantoinu, ukazatele oxidačního stresu, pomocí LC/MS

Význam tématu

Oxidační stres spočívá v nadbytku reaktivních forem kyslíku, které poškozují biomolekuly a podílejí se na patologických procesech v organismu. Alantoin, jako produkt oxidace kyseliny močové, slouží jako citlivý marker oxidačního stresu. Jeho stanovení je klíčové pro sledování stavu antioxidantní ochrany, farmakologický výzkum a vývoj kosmetických přípravků podporujících regeneraci pokožky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, citlivou a robustní LC–MS/MS metodu pro simultánní stanovení alantoinu a kyseliny močové v biologických matricích s minimálním odběrem vzorku. Nová procedura má zjednodušenou přípravu, zkrácenou dobu analýzy a využívá techniku suché kapky krve.

Použitá instrumentace

• Shimadzu LC-20 kapalinový chromatograf
• Shimadzu LCMS 8045 hmotnostní spektrometr v negativním módu ESI (−3000 V, 300 °C)
• Kolona Discovery HS-F5 (Supelco) 3 µm, 2,1 × 150 mm při 37 °C

Použitá metodika

Vzorky (10–30 µL plné krve, plazmy nebo séra) se aplikovaly na filtrační papír, sušily minimálně 3 h a terčík o průměru 6 mm obsahující interní standard se extrahoval směsí vody a acetonitrilu ultrazvukem. Chromatografie probíhala isokraticky s mobilní fází 10 % acetonitrilu ve vodě + 0,1 % kyseliny mravenčí při průtoku 0,2 mL/min a trvání 3 min. Detekce byla realizována v režimu MRM pro alantoin, kyselinu močovou a jejich stabilní izotopové interní standardy.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimální extrakce byla dosažena při 80 % acetonitrilu s relativní výtěžností kolem 80 %. Chromatogramy prokázaly rychlou separaci obou analy­tů pod 3 min bez výrazných interferencí matrice. Metoda vykázala lineární odezvu, nízké limity detekce a reprodukovatelnou opakovatelnost měření.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální objem vzorku a neinvazivní odběr suchou kapkou krve
• Zjednodušená příprava a stabilita vzorků při transportu
• Krátká doba analýzy a vysoká propustnost laboratoře
• Možnost automatizace a aplikace v klinických studiích

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je validace metody podle mezinárodních standardů, porovnání s referenčními postupy a rozšíření o další biomarkery oxidačního stresu. Perspektivní je automatizace přípravy suchých kapek a aplikace ve velkých klinických kohortách.

Závěr

Popsaná LC–MS/MS metoda přináší rychlé, citlivé a reproducibilní stanovení alantoinu a kyseliny močové s minimálním odběrem vzorku. Díky jednoduché přípravě a krátkému času analýzy nachází široké uplatnění v biomedicínském výzkumu i klinické diagnostice.

Reference

• Ren X. Bioanalysis. 2010;2:1469–1475.
• Wagner M. Mass Spectrometry Reviews. 2016;35:361–438.