HPLC.cz 2025 - Sborník abstraktů přednášek a plakátových sdělení

Význam tématu
Kapilární elektroforéza (CE) a kapilární izotachoforéza (CITP) patří k vysoce účinným technikám separace, nabízejícím vysoké rozlišení i citlivost pro analýzu a charakterizaci bílkovin, peptidů a nanoobjektů. V posledních letech se tyto metody uplatňují jak v rutinní praxi, tak ve výzkumu pro stanovení čistoty syntetických peptidů, analýzu monomicroheterogenity protilátek nebo měření velikosti a náboje nanočástic.

Cíle a přehled studie
Cílem prezentovaných studií je demonstrovat možnosti využití CE a CITP pro:

• Kvantitativní stanovení a kontrolu čistoty syntetických peptidů (PrRP, CARTP, ghrelin a jejich lipidované analogy) a stanovení obsahu kontaminujících aniontů.
• Analýzu mikroheterogenity terapeutických proteinů (monoklonálních protilátek) prostřednictvím CZE-ESI-MS.
• Stanovení acidobazických konstant (pKa) a skutečných iontových mobilit (μ) (lipo)peptidů podporujících regulaci příjmu potravy.
• Charakterizaci nanoobjektů (nanopartikulí, 2D materiálů, nanotub) pomocí CE a Taylorovy disperzní analýzy (TDA) hyphenované s ICP-MS pro určování velikosti a koncentrace.

Použitá metodika a instrumentace
CZE, CITP: kapiláry 50 μm/375 μm, 399/297 mm; BGE s kyselinami (formiová, octová) či s pH pufry (Tris/H3PO4, pH 8,1), mobilní fáze v pH 2–12; SDS pro MEKC; tan-demová MS (ESI, ESI-MS, ESI-QqQ, ESI-IT); ICP-MS pro TDA.
Analytické postupy:

• Měření efektivních iontových mobilit vs. pH pro výpočet pKa a μ skutečných forem (nonlin. regrese).
• CITP analýza pro stanovení efektivního náboje (lineární závislost délky zóny vs. náboj).
• MEKC pro analýzu neutrálních látek (nanoparticles, diastereomery brefeldinu A).

Hlavní výsledky a diskuse
Peptidy:

• Stanovení čistoty PrRP, CARTP a ghrelinových analogů: čistota 32–92 %.
• pKa lipopeptidů: COOH 1,69–2,98, Asp-COOH 2,01–3,59, Glu-COOH 3,23–4,76, Tyr-OH 9,74–9,97, His-imid. 5,83–7,20, α-NH3+ 7,24–7,90, Lys-ε-NH3+ 10,01–10,34, Arg-guanid. 10,64–11,24.
• Skutečné mobilita iontů: paralela mobilit a velikosti (hydrodynamického poloměru).

Protilátky:

• Mikroheterogenita monoklonálních protilátek: detekce nábojových trénů a isoform (posttranslačních modifikací).

Nanoobjekty:

• TDA-ICP-MS: možnost simultánního určení velikostního rozdělení a koncentrace nanopartikul ve směsích.
• CE separace před TDA: zvýšení přesnosti určení velikosti a kon-centrace za přítomnosti vlastních iontů nanočástic.

Přínosy a praktické využití metod
CZE a CITP poskytují:

• Vysoké rozlišení a citlivost pro analýzu bílkovin, peptidů i nanoobjektů.
• Možnost stanovení acidobazických a elektromigračních vlastností látek pro modelování jejich chování v roztocích.
• Rychlé stanovení náboje a agregace nanočástic pro farmaceutické a materiálové aplikace.
• Alternativu k chromatografickým metodám při nízkém objemu vzorku a minimální spotřebě činidel.

Budoucí trendy a možnosti využití
Rozvoj mikrochipových a nanofluidních CE zařízení; kombinace s vysokorozlišovací MS (orbitrap, TOF) pro nekonvenční matriční studie; vývoj interních standardů pro CITP při určení náboje nanočástic; automatizace přípravy vzorků; integrace TDA-ICP-MS do online setupů pro on-the-fly charakterizaci nanoformulací.

Závěr
Capilární elektroforéza a izotachoforéza představují všestranné nástroje pro detailní analytickou a fyzikálně-chemickou charakterizaci peptidů, proteinů a nanoobjektů. Výsledky potvrzují jejich vysoké rozlišení, citlivost a široké možnosti aplikace ve farmaceutické, bioanalytické i materiálové vědě.

Reference
1. Štěpánová S. et al., Electrophoresis 45 (2024) 687–705.
2. Štěpánová S., Kašička V., J. Sep. Sci. 47 (2024) 2400174.
3. Baron D. et al., Anal. Chem. 96 (2024) 5658–5663.
4. Petr J. et al., Electrophoresis 31 (2010) 2754–2761.