A Single Injection LC-MS Analysis Scheme for Simultaneous Analysis of Biotherapeutics and Host-Cell Impurities via Online Digestion LC-MS/MS

Význam tématu

Online integrace trávení bílkovin s LC-MS analýzou nabízí rychlý a reprodukovatelný přístup k charakterizaci bioterapeutik a doprovodných hostitelských proteinů v jednom běhu. Tento přístup usnadňuje kontrolu kvality terapeutických protilátek a detekci kontaminantů z buněčných lyzátů, čímž se zvyšuje efektivita a spolehlivost laboratorních workflow.

Cíle a přehled studie

Studie představuje plně automatizované schéma jediné injekce kombinující online proteolytickou digesci, afinitní pulldown, analýzu intaktní hmotnosti a peptidové mapování cílových terapeutik i hostitelských proteinů. Cílem je demonstrovat simultánní identifikaci a kvantifikaci bioterapeutik (humaní IgG) a proteinových impurit v HEK293 lyzátu.

Použitá metodika

Workflow se odvíjí ve třech paralelních fázích:

• Online trávení: Trypsinem při 50 °C po dobu 4 minut.
• Afinitní pulldown: Protein A/G kolona pro selektivní vazbu/depleci IgG.
• Separační gradient: 2–35 % acetonitrilu (0,15 mL/min, 90 min) pro RP separaci peptidů i intaktních proteinů.

Použitá instrumentace

• Stanoviště Perfinity Workstation (Shimadzu/Perfinity BioSciences)
• LC-MS systém Shimadzu 9030 QTOF
• RP kolony: C18 Aeris peptide Widepore 2.1×50 mm a Restek Ultra C4 150×2.1 mm
• Afinitní kolona: Protein A (Perfinity BioSciences)
• Mobilní fáze: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě a acetonitrilu

Hlavní výsledky a diskuse

Online trávení undiluted HEK293 lyzátu vedlo k identifikaci desítek vysoce až středně expresovaných proteinů (např. EF1A1, NEST, PGAM1). Afinitní deplece IgG umožnila selektivní trávení buněčných proteinů bez detekce IgG peptidů. Naopak afinitní eluční krok obohatil vzorek o IgG peptidy s minimálním zastoupením hostitelských proteinů. Intaktní hmotnostní analýza NIST mAb prokázala shodu s očekávanou molekulovou hmotností pomocí dekonvoluce spektra.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí výrazné zkrácení doby přípravy vzorku, minimalizaci manuálních zásahů a možnost paralelního sběru dat pro intaktní hmotnost i peptidové mapování. Je vhodná pro QA/QC kontrolu biologických léčiv, sledování hostitelských kontaminantů a výzkumné projekty v biotechnologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na jiné třídy proteinových terapeutik a monoklonálních protilátek.
• Optimalizace proteolytických podmínek a afinitních materiálů pro zlepšení selektivity a citlivosti.
• Integrace s dalšími instrumenty (např. ion mobility, HR-MS) pro komplexní charakterizaci modifikací.

Závěr

Prezentované schéma jediné injekce spojuje online trávení, afinitní separaci a LC-MS analýzu v jednom běhu. Umožňuje simultánní identifikaci a kvantifikaci terapeutických bílkovin a hostitelských impurit, čímž zvyšuje efektivitu laboratorních procesů a kvalitu analytických výsledků.