Evaluation of Undifferentiated State of Human iPS Cells Using C2MAP™ Cell Culture Media Analysis Platform

Význam tématu

Regenerativní medicína a průmyslová výroba lidských iPS buněk vyžadují spolehlivé techniky hodnocení buněčného stavu bez narušení kultury. Tradiční metody založené na analýze genové exprese jsou invazivní a využitelné až po ukončení kultivace. Platforma C2MAP založená na LC-MS/MS umožňuje neinvazivní analýzu složení kultivačního média, což přináší rychlou a automatizovanou zpětnou vazbu o diferenciaci buněk.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo ověřit možnost detekce biomarkerů indikujících nediferencovaný stav lidských iPS buněk a jejich diferenciaci k ektodermu prostřednictvím analýzy kulturálního supernatantu. Studie kombinuje simultánní analýzu 95 metabolitů, statistické nástroje C2MAP TRENDS a Multi-omics Analysis Gadget Package pro identifikaci charakteristických molekul.

Použitá metodika a instrumentace

Úvodní kultivace:

• Buněčná linie: lidské iPS buňky (PFX#9)
• Medium: TeSR-E8 na scaffoldu Vitronectin-N
• Seeding: 1×10^5 buněk na jamku v 6-jamkové destičce
• Výměna média a odběr supernatantu každých 24 h po dobu 6 dnů

Analytika:

• Platforma C2MAP s LC-MS/MS pro simultánní analýzu 95 sloučenin
• Softwarové nástroje: C2MAP TRENDS, Multi-omics Analysis Gadget Package
• Quantifikace: metoda vnějšího standardu a standardní přídavky

Stimulační podmínky:

• Rozlišení diferenciace ektodermu přidáním cytokinů a inhibitorů enzymů (IDO1, AhR antagonist, KAT2 inhibitor)

Hlavní výsledky a diskuse

1. Detekce měřených sloučenin:

• Z 95 analyzovaných komponent bylo ve supernatantu detekováno 55.

2. Identifikace biomarkerů:

• Kynurenin byl statisticky zvýšen v supernatantu nediferencovaných buněk.
• 2-Aminoadipová kyselina byla specificky zvýšena u ektodermálně diferencovaných buněk.

3. Časový průběh:

• U nediferencovaných buněk se spotřeba tryptofanu zvyšovala, zatímco sekrece kynureninu rostla.
• U ektodermu koncentrace 2-aminoadipové kyseliny průběžně narůstala.

4. Mechanistické studie:

• Inhibice IDO1 nebo blokáda AhR vedla ke snížení růstu nediferencovaných buněk a potlačení sekrece kynureninu.
• Kyn-AhR komplex zvyšuje expresi transkripčních faktorů POU5F1, NANOG, EP300, AHR a IDO1, které udržují pluripotenci.
• 2-Aminoadipová kyselina vzniká převážně oxidací kynureninu (KAT2 cesta), nikoli metabolismem lysinu, a její inhibice tlumí ektodermální diferenciaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Non-invazivní monitorování stavu buněk v reálném čase bez odběru buněk.
• Rychlá a automatizovaná analýza desítek metabolit pro screening biomarkerů.
• Podpora QA/QC procesů při výrobě buněčných léčiv a výzkumných kultur.
• Možnost rozšíření panelu biomarkerů pro různé směry diferenciace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace C2MAP s dalšími omickými technologiemi a umělou inteligencí pro prediktivní modely diferenciace. Rozvoj online monitorování metabolismu v bioreaktorech a adaptace na vysokopropustné screeningové platformy. Využití v personalizované medicíně pro optimalizaci růstových podmínek buněčných terapií.

Závěr

Platforma C2MAP pro LC-MS/MS analýzu buněčného supernatantu umožňuje neinvazivní identifikaci klíčových biomarkerů stavu lidských iPS buněk. Kynurenin a 2-aminoadipová kyselina jasně rozlišují mezi nediferencovaným a ektodermálně diferencovaným stavem. Studie rovněž odhaluje mechanismus udržování pluripotence prostřednictvím kynurenin-AhR osy.

Reference

1. T. Yamamoto, K. Hatabayashi, M. Arita, N. Yajima, C. Takenaka, T. Suzuki, M. Takahashi, Y. Oshima, K. Hara, K. Kagawa, S. Kawamata: Kynurenine signaling through the aryl hydrocarbon receptor maintains the undifferentiated state of human embryonic stem cells, Sci. Signal. 12, eaaw3306 (2019).