A Comprehensive N-Glycan Profiling Analysis of Bevacizumab Biosimilar by UHPLC with Fluorescence Detection and Q-TOF Mass Spectrometry

Význam tématu

N-glykanové profily u monoklonálních protilátek výrazně ovlivňují jejich stabilitu, biologickou aktivitu a imunogenicitu. S nástupem biosimilárních verzí drahých léčiv jsou přesné analytické metody klíčové pro srovnání glykanového pachu s referenčním přípravkem. Robustní charakterizace N-glykanů podporuje důvěru regulačních orgánů i klinické účinnosti biosimilárních mAb.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a validovat citlivý, reprodukovatelný a rychlý postup pro uvolnění, značení, separaci, detekci a kvantifikaci N-glykanů u bevacizumab biosimiláru. Studie kombinuje UHPLC s fluorescenční detekcí a Q-TOF hmotnostní spektrometrií, umožňuje identifikaci devíti 2-AB značených glykanů a stanovuje jejich relativní zastoupení.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla použita směs následujících kroků:

• Denaturace: roztok bevacizumabu 1 mg/mL v Tris pufru, odstranění solí MWCO 10 kDa.
• Redukce a alkylace: DTT (1 M) a IAA (1 M) při pokojové teplotě pro rozrušení disulfidických vazeb.
• Deglykosylace: PNFase F při 37 °C přes noc k uvolnění N-glykanů.
• Extrakce a čištění: LudgerClean™ EB10 a LudgerClean™ S kartridže pro očistu a odstranění přebytečného 2-AB.
• Značení: 2-aminobenzamid (2-AB) v acetonitrilu/ kyselině octové/DMSO/sodném cyanoborhydridu.

Chromatografie:

• UHPLC systém: Shimadzu Nexera Bio UHPLC s HALO® Glycan sloupcem (2.7 μm, 150×2.1 mm) při 60 °C.
• Mobilní fáze: A – 50 mM ammonium formiát, B – acetonitril; gradient 78→55→20→78 % B v časech 0–50–51–57 min při průtoku 0.4 mL/min.
• Detekce: RF-20A fluorescenční detektor (Ex 330 nm, Em 420 nm), objem injekce 5 μL.

Hmotnostní spektrometrie:

• Systém: Shimadzu LCMS-9030 (Q-TOF) s HESI rozhraním (+), napětí 4 kV, teplota rozhraní 300 °C, suchý plyn N₂ 10 L/min.
• Režim: MS scan (500–2500 m/z) a MS/MS scan (100–2500 m/z) s kolizní energií 50±17 V.

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí LC/fluorescence/MS bylo detekováno a charakterizováno devět 2-AB značených N-glykanů: Man3, G0F-2GN, G0-GN, G0F-GN, G0, Man5, G0F, G1Fa, G1Fb. Relativní kvantifikace prokázala:

• G0F tvoří 87,23 % celkových glykanů a je nejhojnější strukturou.
• Man3 je nejméně zastoupen (0,7 %), ostatní glycany se pohybují mezi 0,7 a 5 %.

Reprodukabilita UHPLC/RF vykázala RSD <2 % pro plochy a retenční časy při třech po sobě jdoucích injekcích. Přesnost stanovení hmotnosti byla lepší než 1 ppm (mass error <1 ppm) pro všechny analyzované glykanové struktury.

Přínosy a praktické využití metody

Tento analytický postup umožňuje spolehlivou charakterizaci a kvantifikaci N-glykanů u biosimilárních mAb. Klinické laboratoře a vývojové skupiny získají:

• Vysokou citlivost a selektivitu díky kombinaci fluorescenční detekce a Q-TOF MS.
• Rychlou a opakovatelnou analýzu s minimálními variančními odchylkami.
• Jednoduchou standardizaci metodiky pro QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat:

• Integraci vysokorozlišovací MS/MS metod pro detailní mapování izobarických glykanových izomerů.
• Automatizaci přípravných kroků a využití microfluidních platforem.
• Využití AI-řízených nástrojů pro rychlejší identifikaci a kvantifikaci glykanů v rámci procesního inženýrství.

Závěr

Popsaný postup založený na UHPLC s fluorescenční detekcí a Q-TOF MS je robustní, reprodukovatelný a citlivý nástroj pro profilování N-glykanů u bevacizumab biosimiláru. Metoda splňuje požadavky na přesnost, rychlost a validaci, což ji činí vhodnou pro regulované aplikace v biopharmaceutickém průmyslu.

Reference

1. LudgerClean™ EB10 guide. Ludger.
2. Keser T. et al. Comparison of 2-Aminobenzamide, Procainamide and RapiFluor-MS… Front Chem 2018, 6:324.
3. LudgerClean™ S guide. Ludger.