Glycosylated and Deglycosylated Subunit Analysis of Antibody Drug Conjugates

Význam tématu

Antibody-drug conjugáty (ADC) představují cílené bioterapeutikum kombinující monoklonální protilátku a cytotoxický náklad. Pro zajištění stability, bezpečnosti a účinnosti je klíčové přesně stanovit poměr vázaných molekul léku na protilátku a glykozilační profil. Analýza na subjednotkové úrovni umožňuje detailní kvantifikaci modifikací těžkého a lehkého řetězce.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout rychlý, robustní a efektivní postup pro analýzu glykozylovaných i deglykozylovaných subjednotek ADC typu trastuzumab emtansine pomocí stolního QTOF hmotnostního spektrometru X500B a softwaru BioPharmaView. Studie se zaměřila na determinaci multiplicity vázaných cytotoxinů (DM1) a výpočet drug-antibody ratio (DAR) pro jednotlivé řetězce.

Použitá instrumentace

Reagencie

• PNGase F (New England BioLabs)
• Tris-(2-karboxyethyl) fosfin (TCEP, Sigma)

LC podmínky

• Kolona: Agilent Poroshell 300SB-C8, 1,0 × 75 mm, 5 μm
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina formiová ve vodě
• Mobilní fáze B: 0,1 % kyselina formiová v acetonitrilu
• Průtok: 0,2 mL/min, teplota 75 °C, doba analýzy 10 min

MS parametry (X500B QTOF, ExionLC, SCIEX OS)

• Curtain Gas: 30; GS1/GS2: 50
• Ion Spray Voltage: 5000 V; zdrojová teplota 400 °C
• TOF hmotnostní rozsah: 900–4000 m/z; DP 250 V
• Čas akumulace: 0,5 s; počet časových binů: 80
• Intact Protein Mode a Large Proteins (>70 kDa) On; Decrease Detector Voltage On

Hlavní výsledky a diskuse

Redukcí disulfidů byla získána spektra lehkého a těžkého řetězce ADC. Glykozylované vzorky odhalily přítomnost až dvou DM1 na lehkém a až tří DM1 na těžkém řetězci. Výpočet DAR pomocí BioPharmaView ukázal pro glykozylované subjednotky hodnoty 0,59 (lehký řetězec) a 1,07 (těžký řetězec). Distribuce modifikací: lehký řetězec – 55 % bez nákladu, 32 % s jedním DM1, 13 % se dvěma; těžký řetězec – 34 % bez, 35 % s jedním, 22 % se dvěma, 9 % se třemi. Ve spektru byl detekován i nízce intenzivní posun +221 Da, odpovídající modifikovanému linkeru bez DM1, v souladu s literaturou. Deglykozylovaná data potvrdila stejné vzory modifikací s DAR 0,52 pro lehký a 1,01 pro těžký řetězec.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda umožňuje rychlou analýzu subjednotek ADC bez složité přípravy vzorku, nabízí vysokou citlivost a reprodukovatelnost. Softwarové zpracování usnadňuje hromadné vyhodnocení kritických parametrů, jako je DAR a glykozilační profil, což je klíčové pro kontrolu kvality při vývoji a výrobě ADC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Předpokládá se další automatizace a zkrácení času analýzy, rozšíření aplikace na různé typy ADC a integrace pokročilých bioinformatických nástrojů. Metoda může být kombinována s imunoprecipitací a dalšími přípravnými kroky pro specifickou izolaci cílových modifikací a podporu vysokoprůchodnostního QC.

Závěr

Prokázali jsme rychlý, jednoduchý a spolehlivý workflow pro analýzu glykozylovaných i deglykozylovaných subjednotek ADC na platformě X500B QTOF. Metoda umožňuje přesné stanovení DAR a sledování glykozilačních variant v rámci rutinní kontroly kvality.

Reference

1. Michael T. Kim, Yan Chen, Joseph Marhoul, Fred Jacobson. Statistical Modeling of the Drug Load Distribution on Trastuzumab Emtansine Kadcyla a Lysine-Linked Antibody Drug Conjugate. Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1223–1232.
2. Yan Chen, Michael T. Kim, Laura Zheng, Galahad Deperalta, Fred Jacobson. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine Kadcyla. Bioconjugate Chem. 2016, 27, 2037–2047.
3. Liuxi Chen, Lan Wang, Henry Shion, Chuanfei Yu, Ying Qing Yu, Lei Zhu, Meng Li, Weibin Chen, Kai Gao. In-depth structural characterization of Kadcyla ado-trastuzumab emtansine and its biosimilar candidate. MAbs. 2016, 8(7), 1210–1223.