Fast Protein Identification Experiments with Microflow LC – Up to 100 Samples per Day

Rychlá identifikace proteinů pomocí microflow LC a TripleTOF® 6600

Význam tématu
Proteomika vyžaduje rychlé a spolehlivé analytické postupy pro identifikaci proteinů. Tradiční nanoflow chromatografie omezuje průchod laboratorními vzorky vysokou dobou cyklu, zatímco microflow LC přináší stabilnější separaci a robustnější electrospray ionizaci.

Cíle a přehled studie
Autoři studie zkoumali možnosti zkrácení doby běhu LC metod na 5 až 45 minut při zachování citlivosti a počtu identifikovaných proteinů. Výzkum se zaměřil na data dependent acquisition s využitím systému TripleTOF 6600 a gradientů microflow.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: NanoLC™ 425 v módu trap/elute, tok 5 µl/min, gradienty 5, 10, 20 a 45 min, kolona na 30 °C.
• Hmotová spektrometrie: TripleTOF® 6600 s Turbo V™ Source a 25 µm hybridními elektrodami.
• Akvizice dat: DDA s TOF MS scanem 150 ms, MS/MS cykly až 90 spektrem/s, akumulační časy 15–25 ms.
• Software: ProteinPilot™ 5.0 s Paragon™ a Pro Group™ algoritmy, hodnocení FDR pomocí šablony FDR Comparison Template.

Přehled metodických optimalizací
Výzkum zahrnoval optimalizaci parametrů spouštění MS/MS, intenzity prahu pro trigger a času akumulace. Zvýšení počtu MS/MS na cyklus a snížení akumulačních časů (do 15 ms) zvyšuje počet identifikací bez zásadní ztráty kvality spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

• Gradienty 20–45 min poskytují srovnatelné počty peptidů (>9000) a proteinů (>1000) při 1 µg zátěže.
• 10minutový gradient umožňuje identifikovat ~70 % proteinů a ~9000 peptidů ve srovnání s 45min režimem.
• 5minutový režim přináší až 5000 peptidů a 50 % identifikaci proteinů oproti delším běhům.
• Zvýšení zátěže z 0,5 na 2 µg zvyšuje počet peptidů o ~13 % a proteinů o ~8 %.

Přínosy a praktické využití metody
Rychlá microflow LC spolu s vysokou akviziční frekvencí TripleTOF 6600 umožňuje zpracovat až 100 vzorků za den. Metoda je vhodná pro vysoce propustné proteomické screeningy, rychlou validaci biomarkerů a QA/QC v biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zkracování gradientů a zvyšování MS/MS akvizičních frekvencí.
• Integrace SWATH a DIA přístupů pro kvantitativní analýzy bez nutnosti DDA.
• Automatizace přípravy vzorků a spojení s dalšími separačními metodami.
• Využití strojového učení pro optimalizaci protokolů a pokročilou analýzu dat.

Závěr
Microflow LC v kombinaci s TripleTOF® 6600 prokázala vysokou robustnost a průchodnost až 100 vzorků za den. I extrémně krátké chromatografické běhy (5–10 min) poskytují vysoce kvalitní identifikace proteomů při minimálním kompromisu citlivosti.

Použitá instrumentace

• NanoLC™ 425 System (SCIEX)
• TripleTOF® 6600 System s Turbo V™ Source
• ProteinPilot™ Software 5.0

Reference

1. SCIEX. SWATH Performance Kit SOP.
2. SCIEX. FDR Comparison Template for ProteinPilot Software.
3. SCIEX. Optimized Collision Energy Curves for TripleTOF Systems.
4. SCIEX. ProteinPilot™ Software Overview, RUO-MKT-02-1777-C.
5. SCIEX. Global vs Local False Discovery Rate Rates.