Accelerating Protein ID for Deep Proteome Profiling

Význam tématu

Hluboká proteomová profiling vyžaduje účinnou frakcionaci a rychlou chromatografii, aby bylo možné detekovat co nejvíce proteinů z komplexních vzorků. Kombinace vysokého rozlišení dělení peptidů a rychlé mikroflow LC-MS/MS analýzy významně zkracuje dobu instrumentace a zachovává kvalitní pokrytí proteomu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na urychlení identifikace proteinů z digesce lidského HeLa buněčného lyzátu pomocí dvoudimenzionální frakcionace při vysokém pH následované mikroflow LC-MS/MS na systému TripleTOF 6600. Cílem bylo dosáhnout hlubokého pokrytí proteomu při podstatně kratší době měření.

Použitá metodika a instrumentace

2D frakcionace vysokého pH:

• Systém Shimadzu Nexera s UV detekcí (214 nm)
• Durashell RP kolona 250×4,6 mm, 5 μm, průtok 1 mL/min
• Gradient 2–90 % acetonitrilu v 2 mM amoniaku, odběr 15 frakcí každé 2 minuty

1D mikroflow LC-MS/MS:

• NanoLC 425 v mikroflow režimu, průtok 5 μL/min
• Triart C18 kolona 150×0,3 mm, gradient 2–40 % acetonitrilu v 0,1 % kyselině mravenčí za 45 min, celkem 1 h běhu na frakci

Hmotnostní spektrometrie:

• TripleTOF 6600 s DuoSpray zdrojem a 25 μm hybridní elektrodou
• Data dependent acquisition (IDA), 30 MS/MS spekter na cyklus, 40 ms akumulace

Zpracování dat:

• ProteinPilot Software 5.0 s algoritmy Paragon a Pro Group
• Globální FDR 1 %, vizualizace výsledků pomocí automaticky generovaných reportů

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza 15 frakcí za 15 hodin MS času vedla k identifikaci více než 7 100 proteinů a 106 000 peptidev při 1 % FDR. Průměrně bylo ve frakci detekováno ~9 000 jedinečných peptidů, přičemž pouze 25 % byly redundatní mezi frakcemi. Mikroflow LC poskytlo medián šířky píků 7,2 s (půl výška), 90 % MS/MS spekter bylo získáno při minimálně 50 % výšky píku, což přispělo k vysoké kvalitě spekter. Celkem 83 % spekter bylo úspěšně přiřazeno během databázového vyhledávání a většina proteinů byla potvrzena minimálně dvěma peptidy.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy při zachování šířky proteomického pokrytí
• Vysoká robustnost a reprodukovatelnost mikroflow režimu
• Vhodné pro rychlou přípravu spektrálních knihoven a QA/QC rutiny

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zrychlení pomocí zkrácených gradientů a rychlejších MS metod
• Integrace s SWATH akvizicí pro kvantitativní a posttranslační analýzu
• Využití strojového učení pro zlepšení identifikačních algoritmů a automatizaci zpracování dat

Závěr

Ukázalo se, že spojení vysokopH frakcionace a mikroflow LC-MS/MS na systému TripleTOF 6600 umožňuje rychlou a spolehlivou identifikaci tisíců proteinů z komplexních vzorků. Metoda představuje efektivní postup pro hluboký proteomový profil s krátkou dobou instrumentace a vysokou kvalitou dat.

Reference

1. ProteinPilot Software Overview, SCIEX Technical note RUO-MKT-02-1777-A.
2. ProteinPilot Report for ProteinPilot Software – Detailed Analysis of Protein Identification / Quantitation Results Automatically, SCIEX Technical note RUO-MKT-02-1778-A.