Quantitative LC-MS Solution for Targeted Analysis of Cell Culture Media

Význam tématu

Analýza složení médií buněčné kultivace je klíčová pro optimalizaci výroby moderních bioterapeutik. V rámci principu kvality navržené už od začátku (Quality by Design) je nezbytné detailně sledovat změny koncentrací živin, metabolitů i dalších klíčových složek během pěstování buněk. Tyto údaje umožňují včasné odhalení odchylek v procesu, zajišťují konzistentní kvalitu produktu a urychlují vývoj i škálování výroby.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout kvantitativní LC-MS/MS metodu schopnou v jediné analýze detekovat a přesně kvantifikovat přes 110 složek běžných médií buněčné kultivace. Metoda využívá robustní kombinaci rychlého chromatografického rozlišení a vysoce citlivé hmotnostní spektrometrie, aby umožnila komplexní profilování aminokyselin, vitaminů, sacharidů, mastných a nukleových kyselin, anorganických i dalších organických látek.

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr SCIEX QTRAP® 6500+ nebo Triple Quad™ 6500+
• Vysokotlaký kapalinový chromatograf ExionLC™
• Kolonka Phenomenex Kinetex® F5 (150 × 2,1 mm, 2,6 µm)
• Software SCIEX OS-Q 1.5 se sadou MIDAS™ a Accurate Mass Metabolite Spectra Library (AMMSL)

Metodika

Příprava vzorku zahrnovala smíchání standardního master-mixu jednotlivých analytů (6,67–20 µg/ml) a 5× až 300× naředění vzorku komerčního CD CHO média 0,1 % kyselinou formiovou v acetonitrilu. Chromatografie probíhala v 20minutovém gradientu (flow 200 µl/min, 40 °C) s mobilní fází A (0,1 % kyseliny formiové ve vodě) a B (0,1 % kyseliny formiové v acetonitrilu).
Hmotnostní spektrometrie využila naprogramované sMRM™ přechody (178 pozitivních a 54 negativních) s optimalizovanými cykly a dobami akumulace signálu. Pro potvrzení identity sloučenin byl použit MIDAS™ workflow pro sběr full MS/MS fragmentací a porovnání s knihovnou AMMSL. Kvantifikace se prováděla v SCIEX OS-Q pomocí MQ4 algoritmu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje:

• Vynikajícího rozlišení polar­ních i nepolárních látek díky pětifunkční chromatografii na F5 kolonce.
• Rozlišení isomerů, např. L-leucin/L-isoleucin, L-cystein/L-cystin či L-arginin s metabolity L-ornitin a L-citrulin.
• Lineární dynamický rozsah 2 až 6 řádů s limity kvantifikace v sub-ng/ml oblasti (LLOQ do 0,001 ng/ml u vybraných látek).
• Vysoké opakovatelnosti a regresní koeficienty R² průměrně kolem 0,99.

Vizualizační modul OS-Q umožňuje sledovat změny koncentrací vybraných indikátorů (aminokyseliny, vitaminy, sacharidy, mastné kyseliny, nukleové kyseliny, organické kyseliny) v čase buněčné kultivace, což usnadňuje rozhodování o doplňování živin a optimalizaci procesu.

Přínosy a praktické využití

• Jednorázová analýza stovek klíčových složek média šetří čas i materiál
• Podpora strategií Quality by Design a in-process monitoringu
• Rychlá adaptace na jiná chromatografická zařízení i zdroje ionizace
• Vysoká citlivost i pro kyselejší i zásaditější složky díky polaritnímu přepínání
• Ucelený software pro řízenou kvantifikaci i identifikaci

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody o stabilně značené vnitřní standardy pro ještě vyšší přesnost kvantifikace Rozšíření knihoven metabolit pro multi-omické přístupy Integrace s automatizovanými platformami pro vysokoprozvodovou analýzu Vazba na procesní analytické technologie (PAT) a online monitoring média Úprava metod pro nově vyvíjená média i netradiční bioprodukty

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda na SCIEX QTRAP 6500+ s ExionLC představuje vysoce výkonné řešení pro cílenou kvantifikaci složek buněčných kultur. Kombinuje široké chemické pokrytí, robustní chromatografii, špičkovou citlivost i rychlost analýzy. Podporuje tak spolehlivé sledování a optimalizaci bioprodukčních procesů.

Reference

1 Eagle H. Science 1959, 130, 432.
2 Schinke R. J. Biol. Chem. 1964, 239(1), 136.